生物被膜在沙门菌逃逸肠黏膜树突状细胞免疫监视中的作用和机制

The intestinal tract is the primary invasion site for the S.typhimurium. Intestinal mucosal dendritic cells (DCs) can form transepithelial dendrites (TEDs) to sample luminal bacteria for establishing immune surveillance system. However, S.typhimurium can form the biofilm in general, which enhances the infection ability to host. It remains unclear whether biofilm affects the function of the immune surveillance of intestinal mucosal dendritic cells to S.typhimurium. The following experiments will be performed. First, biofilm formation (wild type) and deletion strains are selected, and the effects of biofilm and their components on the ability of TEDs formation and bacteria uptake will be studied in vitro intestinal epithelial cells/DCs coculture model and in vivo mice ligated loop model. Second, DCs activation and maturation will be detected, including phagocytosis, activation markers, phenotype, migration, cytokines, and lymphocytes proliferation and differentiation. Third, during the recognition of S.typhimurium by DCs toll like receptors, the key role of biofilm and their components will be further clarified by using over-expression/interference technology and knockout mice models. This study will objectively explain the internal relations between S.typhimurium and intestinal mucosal immunity, and lay the foundation for further clarifying pathogenesis mechanism of S.typhimurium.

鼠伤寒沙门菌主要从肠黏膜入侵，而肠黏膜树突状细胞（DCs）可通过形成跨上皮树突摄取肠腔内沙门菌等方式建立早期免疫监视体系。但环境中沙门菌往往以生物被膜状态存在，且对宿主的感染力增强。那么，生物被膜是否会影响肠黏膜DCs对沙门菌的免疫监视功能，目前仍不清楚。因此开展如下研究：（1）结合体外肠上皮细胞/DCs共培养模型和体内小鼠肠结扎模型，选用鼠伤寒沙门菌生物被膜形成株（野生型）和缺失株，研究生物被膜及其成分对肠黏膜DCs跨上皮树突形成及捕获细菌能力的影响；（2）比较生物被膜形成及缺失株对DCs活化和成熟的影响，包括吞噬、活化、表型、迁移、细胞因子分泌和刺激T细胞增殖和分化；（3）运用过表达/干扰技术或基因敲除小鼠模型进一步阐明生物被膜及其成分在DCs Toll样受体识别沙门菌过程中的作用。本研究将更客观地解析沙门菌与肠黏膜免疫的相互关系，为进一步阐明沙门菌的致病机理奠定基础。

鼠伤寒沙门菌主要从肠黏膜入侵，而肠黏膜树突状细胞（DCs）可通过形成跨上皮树突摄取肠腔内沙门菌等方式建立早期免疫监视体系。但环境中沙门菌往往以生物被膜状态存在，且对宿主的感染力增强。那么，生物被膜是否会影响肠黏膜DCs对沙门菌的免疫监视功能，目前仍不清楚。本试验通过建立小鼠肠结扎原位灌注模型，结果显示，与生物被膜形成株相比，浮游株能够募集更多的树突状细胞聚集在肠上皮下方，形成跨上皮树突，这些树突可以摄取肠腔中的沙门菌。此外，摄取沙门菌的树突状细胞可以在2h内快速迁移至肠系膜淋巴结并参与抗原递呈。进一步研究发现，与生物被膜形成株相比，浮游株可以显著促进消化道上皮细胞表达趋化因子CCL20，进而募集更多的树突状细胞在黏膜下聚集。CCL20在上皮细胞游离侧分布的方式，也为跨上皮树突的形成提供了可能。结果表明：浮游株增强肠上皮细胞分泌CCL20，募集树突状细胞至肠黏膜下并形成跨上皮树突，进而加强沙门菌的跨上皮转运，这可能是引起下游有效的抗原特异性免疫应答的一个重要机制。黏膜下树突状细胞摄取沙门菌后，将快速转变状态，由未成熟转变为成熟状态，以便下游的抗原递呈过程。因此，在体外小鼠DCs直接互作试验中，通过检测黏膜下方树突状细胞的表型标志表达、细胞因子分泌和混合淋巴细胞反应的能力，评价生物被膜对沙门菌诱导树突状细胞成熟功能转变的情况。结果显示：沙门菌与树突状细胞共作用24h后，与生物被膜形成株相比，浮游株能够显著上调树突状细胞表型标志MHCII、CD40、CD80和CD86的表达，同时强烈刺激树突状细胞分泌促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12p70；混合淋巴细胞反应试验中，在DC:T=1:1和1:5两种细胞比例下，CD4+ T细胞的增殖能力显著增强。结果表明，浮游株可以显著增强黏膜下树突状细胞的成熟能力，这对下游获得性免疫应答的启动具有重要作用。