人博卡病毒样颗粒作为肺癌靶向性纳米基因治疗载体的研究

It is a major challenge to select a reasonable effective gene target and a high-efficient but low-toxic gene vector for gene therapy. Virus-like particles (VLPs) can be used as a novel nanocarrier for gene therapy due to its similar nanostructure with wild-type virus, flexibility, safety and capacity of carrying nucleic acid. Human bocavirus 1 (HBoV1) is the pathogen of a common respiratory disease whose major capsid protein VP3 can be self-assembled to VLPs and accommodate more than 5.4kb of exogenous nucleic acid, which has great potential as a gene therapy vector for respiratory diseases. The objectives of this study: 1) recombinant HBoV1 VLPs were constructed by using the integrin αvβ3 specifically expressed on the surface of tumor cells as a target, and its surface displayed RGD which can specifically recognize αvβ3 as well as packages the Bcl2-siRNA inhibiting lung cancer to investigate the effect of physical and chemical factors on its assembly efficiency and siRNA packaging ability. 2) to evaluate the cell targeting and cytotoxicity in vitro and explore its mechanism of vector-taking by cells and the effect of siRNA on target gene silencing; 3) to explore HBoV1 VLPs targeting of lung cancer in vivo and its biological function of anti-tumor. The results of the project will provide insight into the development of new gene therapy vectors and its potential usage for cancer treatment.

选择合理有效的基因靶点和高效低毒的基因载体一直是基因治疗亟待解决的难题。病毒样颗粒（VLPs）具有良好的修饰性、可靠的安全性和独特的核酸承载力，可作为新型基因治疗载体。人博卡病毒1型（HBoV1）是一种常见呼吸道病毒，其衣壳蛋白VP3可自组装成VLPs并可容纳超过5.4kb的外源核酸，有作为呼吸系统疾病基因治疗载体的巨大潜能。本项目以肿瘤细胞表面特异性表达的整合素αvβ3为靶标，以对肺癌细胞有抑制作用的Bcl2-siRNA为药物模型，构建重组HBoV1 VLPs，其表面展示能特异识别αvβ3的RGD并包装Bcl2-siRNA，研究理化因素对其组装效率及siRNA包装效果的影响；体外评价其细胞靶向性及细胞毒性，探讨其摄取机制，研究siRNA导入后对靶基因沉默功能；体内探究其对肺癌组织的靶向性及抗肿瘤生物学功能。该项目可为发展安全有效的新型基因载体及其在肿瘤基因治疗中的应用提供实验和理论依据。

选择合理有效的基因靶点和高效低毒的基因载体一直是基因治疗亟待解决的难题。病毒样颗粒（Virus-like particles, VLPs）具有良好的修饰性、可靠的安全性和独特的核酸承载力，可作为新型基因治疗纳米载体。人博卡病毒1型（Human bocavirus 1, HBoV1）是一种常见呼吸道病毒，其衣壳蛋白VP3可自组装成VLPs并可容纳超过5.4kb的外源核酸，有作为呼吸系统疾病基因治疗或药物载体的巨大潜能。整合素αvβ3在多种恶性肿瘤细胞表面有高表达，在肿瘤的生长、局部浸润和转移中发挥着重要作用，因而成为肿瘤治疗的理想靶点。RGD (Arg-Gly-Asn)肽是目前研究最多的能特异性结合整合素αvβ3的寡肽。本项目开展了以下工作：1、利用分子生物学技术成功构建了HBoV1野生型VP3和突变型VP3的原核表达质粒（其中突变型VP3是将其优势抗原表位突变成为能特异识别αvβ3的RGD），表达后利用亲和层析技术纯化获得了重组目的蛋白Wt-VP3和M-VP3，在体外自组装形成了大小约25nm，形态较规则的VLPs (Wt-VLPs和M-VLPs)；2、利用MTT法研究表明重组HBoV1 VLPs具有良好的细胞相容性，利用间接免疫荧光和激光共聚焦技术分析其肿瘤细胞靶向性，发现表面展示能特异识别αvβ3的RGD的M-VLPs能更有效进入A549细胞内，用不同内吞抑制剂处理后分析发现VLPs主要是网格蛋白介导的胞吞途径进入胞内。3、以对肺癌细胞有抑制作用的盐酸阿霉素（DOX）为药物模型，构建载药的重组VLPs，利用琼脂糖凝胶电泳检测发现，Wt-VLPs和M-VLPs均能有效包装DOX并将DOX递送至A549细胞内，利用MTT法、流式细胞术以及细胞划痕实验研究发现，Wt-VLPs-DOX和M-VLPs-DOX对肿瘤细胞起到显著抑制效果，M-VLPs-DOX的抑制效果更明显。4、在体外自组装形成M-VLPs过程中能有效包装siRNA (siBcl2)和保护其不被核酸酶所降解，并能有效递送siBcl2到肿瘤细胞内，对细胞靶基因bcl2有显著的沉默效应，从而发挥抗肿瘤效应。5、构建裸鼠皮下肿瘤异位模型，重组M-VLPs-siBcl2对在荷瘤动物体内的靶基因有明显沉默效果，对肿瘤生长有较好抑制作用。该项目可为发展安全有效的新型基因或药物载体及其在肿瘤靶向治疗中的应用提供实验依据。