抑制动粒蛋白CENP-H对乳腺癌紫杉醇化疗的增敏作用及其机制研究

紫杉醇在临床上广泛用于多种肿瘤的治疗，但肿瘤耐药是限制其疗效的关键问题。紫杉醇的主要作用机制是干扰微管的动态装配从而导致细胞周期阻滞和凋亡。鉴于CENP-H作为组成型的动粒蛋白，与微管之间的密切联系，其在有丝分裂中起重要作用；此外CENP-H能显著调控在紫杉醇的敏感性中起重要调节作用的分子Survivin，因此我们推测CENP-H在紫杉醇化疗敏感性中起重要调节作用。预实验结果证实沉默CENP-H能显著增强乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性，然其具体机制有待进一步研究。本课题拟以裸鼠乳腺癌移植瘤为模型进一步验证抑制CENP-H在动物体内对紫杉醇敏感性的影响。然后从CENP-H调节紫杉醇诱导的细胞周期阻滞和凋亡方面分析其作用机制，并进一步从其调控Survivin及用基因芯片筛选其它信号通路分子方面深入探讨其分子机制。本研究有助于阐明紫杉醇化疗敏感性调节的机制，为设计提高紫杉醇疗效的新方法提供科学依据。

.紫杉醇在临床上广泛用于多种肿瘤的治疗，但肿瘤耐药是限制其疗效的关键问题。我们的前期实验结果发现沉默CENP-H能显著增强乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性。在此基础上，本课题构建了CENP-H shRNA逆转录病毒载体；重组质粒经磷酸钙介导转染293FT细胞制备逆转录病毒；对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-435细胞进行逆转录病毒感染，嘌呤霉素筛选获得稳定转染的细胞株，构建了稳定低表达CENP-H的MCF-7和MDA-MB-435乳腺癌细胞株。..MTT实验结果表明，紫杉醇对对照MCF-7和MDA-MB-435细胞作用48h，抑制半数细胞生长所需药物浓度即IC50值分别为47.6 nM和40.2 nM；而对稳定沉默CENP-H的MCF-7 RNAi1和MDA-MB-435 RNAi1细胞作用48h的IC50值分别降低为19.8 nM和14.5 nM。稳定沉默CENP-H能显著增强乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性。..BrdU掺入实验表明，经紫杉醇作用后，稳定沉默CENP-H的MCF-7 RNAi1和MDA-MB-435 RNAi1细胞的BrdU阳性细胞比率明显低于对照细胞。稳定沉默CENP-H能促进紫杉醇诱导的乳腺癌细胞增殖阻滞。.Annexin V-FITC/PI染色、TUNEL免疫荧光染色、caspase酶活性实验证实，经紫杉醇作用后，稳定沉默CENP-H的MCF-7 RNAi1和MDA-MB-435 RNAi1细胞的Annexin V+/PI−阳性细胞比率、TUNEL阳性细胞比率、caspase 8和caspase 9活性明显高于对照细胞。稳定沉默CENP-H能促进紫杉醇诱导的乳腺癌细胞凋亡。.进一步的分子机制研究发现：经紫杉醇处理后，与对照细胞比较，稳定沉默CENP-H的乳腺癌细胞中，凋亡抑制蛋白Survivin表达下调，phospho-Ser473-Akt、phospho-Thr308-Akt表达下调，Akt总蛋白的水平基本未受影响。Akt/Survivin信号转导通路在抑制CENP-H增加乳腺癌紫杉醇化疗敏感性效应中起重要作用。.