Exosomes介导的细胞间信息传递诱导肠癌细胞对抗EGFR单克隆抗体耐药的机制研究

Exosomes are membrane vesicles body secreted by cells, and able to regulate the target cells function via mediating intercellular signal communication. It was reported that colrectal cancer cells with K-RAS mutation could transfer mutated K-RAS to wild type cells. Our results demonstrated that resistant cells-derived exosomes decreased the sensitivity of sensitive cells to anti-EGFR monoclonal antibody. Further investigation revealed that resistant cells-derived exosomes contained more miR-221, miR-29a, miR-1228 and c-Src protein than those from sensitive cells. Bioinformatic study that PIK3R1,PTEN and TP53 are the target genes of the above miRNAs,respectively.And it was reported that dysfunction of these proteins are the major reasons of cells resistant to anti-EGFR monocolonal antibody.Thus,we proposed that resistant cells-derived exosomes might induce the sensitive cells resistant to anti-EGFR monocolonal antibody through intercellular transduction of drug resistant proteins and miRNAs via exosomes.Our study will provide the novel issue for understanding the mechanism of anti-EGFR monocolonal antibody resistance，and reversing drug resistance.

外泌体（Exosomes）是由细胞分泌的膜性小囊泡，可介导泡内蛋白和miRNAs在细胞间传递，对周边细胞进行功能调控。有报告显示K-RAS突变肠癌细胞可以通过Exosomes将突变的K-RAS等耐药分子传递给野生型细胞。我们原创性研究结果证实耐药细胞来源的Exosomes能够降低敏感细胞对抗EGFR单克隆抗体的敏感性，并发现泡内miR-221、miR-29a和miR-1228，以及c-Src蛋白的表达均明显高于敏感细胞。生物信息学研究证实上述miRNAs的靶基因分别为PIK3R1、PTEN和TP53，而文献报告这些蛋白的异常是引起抗EGFR治疗耐药的重要原因。因此，我们推测耐药细胞很可能通过Exosomes将耐药分子和miRNAs传递给敏感细胞，导致更多细胞耐药。本项目通过对耐药细胞-Exosomes-敏感细胞间的信息传递研究，进一步明确抗EGFR单克隆抗体耐药机制，为逆转耐药提供新思路。

西妥昔单抗（C225）是广泛应用于转移性结肠癌的抗表皮生长因子受体（EGFR）人鼠嵌合型Ig1单克隆抗体，原发及继发耐药极大的限制了西妥昔单抗的适用范围及靶向作用。外泌体（Exosomes）是一种具有脂质双分子层，直径在30-100纳米的小囊泡。研究发现，外泌体不仅仅可通过抗原提呈作用激活或抑制免疫细胞，还可以通过携带mRNA，miRNA等遗传物质促进肿瘤细胞的增殖、侵袭转移和耐药的发生。. 我们的研究发现，西妥昔单抗敏感细胞通过摄取耐药细胞来源的外泌体携带的miR-21-5p，靶向负调控PTEN表达，进而激活PI3K/PTEN/Akt信号通路，诱导敏感细胞发生耐药。通过对TCGA数据库结肠癌数据集进行差异性表达分析发现，KRT5基因在右半结肠高表达。在临床研究中，西妥昔单抗应用于左半结肠生存获益明显。为探究左右半差异性表达基因是否与西妥昔单抗耐药相关，利用GEO数据集对西妥昔单抗耐药组与敏感组进行差异性表达基因富集分析显示，KRT5在西妥昔单抗耐药组存在过表达，同时，利用西妥昔单抗耐药与敏感细胞系验证了KRT5的差异性表达。进一步敲除耐药细胞RKO的KRT5后，相比对照组，西妥昔单抗的抑制作用增强，上述结果证实KRT5与西妥昔单抗耐药相关。研究结果为明确西妥昔单抗的继发性耐药提供了理论依据。并且，我们报道了一种新型的BRAF 野生型和BRAF V600E的双重抑制剂。其通过对p-ERK的抑制，能够抑制BRAF V600E突变细胞及BRAF野生/RAS野生或突变肿瘤细胞的增殖。在选择性肠癌细胞系中，AZ304 通过对MAPK/ERK, PI3K/AKT/mTOR和 SRC/STAT3 通路的抑制，能明显抑制BRAF突变/野生肠癌细胞的增殖。另外，无论细胞的BRAF突变状态，AZ304 均能增加西妥昔单抗作用肠癌细胞的敏感性。联合西妥昔单抗作用，还能抑制AZ304对p-EGFR的反馈激活。此外，我们在MKN7细胞中抑制磷酸化Chk1可通过增加DNA损伤这一机制增强其对拉帕替尼的敏感性，而在NCI-N87细胞中上调磷酸化Chk1的表达可减低拉帕替尼对其增殖抑制作用、逆转细胞周期阻滞。综上所述，本研究为肠癌细胞耐药机制进行深入探讨，为临床治疗提供了新的策略。