基于ERα、BubR1蛋白基因甲基化的绝经后骨质疏松症肾虚发病机制研究及补肾方药干预

Our early research suggests that the biological characteristics of osteoblast in osteoporosis patients are significant different from normal，and the development of nephrasthenia syndrome of osteoporosis is attributable to abnormal methylation of estrogen receptor(ER) gene. And it is valuable to research the effect of epigenetic regulation capacity of ER on the genetic consequences of osteoplast in osteoporosis patients and the osteoblast phenotype. To explore these issues, This subject was aimed at detecting the methylated regions and analyzing the deviation of the DNA methylation, through the application of MeDIP(Methylated DNA coimmunoprecipitation) and Methylation- array by informatics method. Surveying the possibility of effection from the level of methylation of ER gene promoter to the level of methylation of the Genome and the development of nephrasthenia syndrome of osteoporosis, and the transmutation of the level of methylation of CpG island in the target gene of estrogen and osteoblast phenotype, this paper was investigated that the significance and mechanism of the epigenetics of ER Gene methylation to the the development of nephrasthenia syndrome of Osteoporosis.

我们前期的研究表明肾虚型绝经后骨质疏松症患者成骨细胞的基因及蛋白表达与正常人有明显差异，其中雌激素受体α(ERα)基因及"衰老蛋白"BubR1甲基化异常与绝经后骨质疏松症肾虚的发生有密切关系。甲基化对ERα及BubR1蛋白基因表达调控及其对肾虚型绝经骨质疏松症会产生什么样的遗传学后果，是否影响成骨细胞表型及肾虚的发生与发展，以及传统补肾方药干预后的变化都值得我们更深入的研究。本课题通过MeDIP(甲基化DNA免疫共沉淀)与甲基化芯片结合，检测特定DNA甲基化差异，运用RT-PCR检测甲基化对BubR1蛋白调控的影响，探讨ERα及BubR1蛋白基因甲基化在肾虚型绝经后骨质疏松症发病中的作用机制及其对成骨细胞表型的影响。同时予传统补肾方药干预，研究补肾方药对绝经后骨质疏松症ERα及BubR1启动子甲基化水平及成骨细胞表型的调控机制，探讨中医药治疗肾阳虚及肾阴虚型绝经后骨质疏松症的机理。

前期研究表明肾虚型绝经后骨质疏松症（PMOP）患者成骨细胞（OB）的基因及蛋白表达与正常人有明显差异，其中雌激素受体α(ERα)基因甲基化异常及衰老蛋白BubR1基因蛋白的异常与PMOP的发生有密切关系。本课题通过MeDIP(甲基化DNA免疫共沉淀)与甲基化芯片结合，检测特定DNA甲基化差异，运用RT-PCR检测甲基化对ERα蛋白调控的影响，探讨ERα蛋白基因甲基化及BubR1基因在PMOP发病中的作用机制及其对OB表型的影响。.应用MSP检测患者骨组织中ERα基因启动子甲基化情况后发现，与非PMOP患者相比，PMOP患者的骨组织内ERα基因启动子甲基化增加，且患者骨密度与ERα基因启动子甲基化程度呈现负相关性。.通过双侧卵巢切除术构建绝经后骨质疏松大鼠模型后，分别给予补肾中药金匮肾气丸（JK），六味地黄丸（W6）和尼尔雌醇干预治疗，发现在中药JK和尼尔雌醇干预下，大鼠的E2水平及骨密度显著提高,而W6的干预下，作用效果不明显。.对原代大鼠OB进行补肾中药干预和功能学实验分析，结果发现补肾中药干预能够抑制成骨细胞内ERα基因启动子甲基化并增加ERαmRNA和蛋白表达，其中，JK的作用更为明显。细胞增殖检测结果显示：W6干预后，OB的增殖活性没有明显变化；JK以50、100 ng/μL的浓度干预处理48 h时，能够显著地增加细胞增殖活性。细胞组化检测结果显示：对于OB早期分化标志物ALP与胶原Ⅰ的表达，W6以100 ng/μL浓度干预时能够增加其表达，JK以50 ng/μL和 100 ng/μL浓度干预处理时能够显著增加其表达，且JK促OB早期分化效果更为明显。此外，WB检测补肾中药干预对影响OB增殖分化的信号通路关键分子表达变化的结果显示JK干预处理能够降低OB内p-AMPK蛋白的表达，增加Wnt通路中β-catenin蛋白的表达。.初步说明补肾中药，特别是JK能通过影响OB内ERα基因启动子甲基化水平进而调控下游的AMPK和Wnt通路调节成骨细胞的分化和骨形成。.查询基因库，发现大鼠体内并无BubR1基因，而人体有。通过收集PMOP与非PMOP患者股骨颈的松质骨组织，提取其总RNA，发现PMOP骨组织的BubR1基因表达较同等年龄者低。用补肾中药JK、雌二醇分别对培养的人OB进行干预，发现JK能通过上调其BubR1基因的转录及翻译。