中药白英甾体生物碱凝集脂筏胆固醇调控肿瘤外泌体生成及功能的抗肿瘤机制研究

Tumor-derived exosomes (TEX) play an important role in cancer. We have found that the steroid alkaloids from Solanum lyratum can direct agglutinate membrane cholesterol to inhibit neovascularization of tumor. Membrane of tumor and TEX are both rich in cholesterol. Steroid alkaloids from Solanum lyratum have the same properties as saponins and can interact with cholesterol, so we put forward the hypothesis that the steroid alkaloids from Solanum lyratum can regulate the production of TEX and inhibit the interactions between TEX and tumor stromal cell through agglutinating cholesterol in lipid raft of tumor or TEX membrane. In order to reveal the mechanism of the steroid alkaloids from Solanum lyratum direct agglutinating membrane cholesterol resulting in regulating of the production and function of TEX, we designed the experimental program both in vitro and in vivo models together with transmission electron microscopy, western blotting, immunofluorescence and transcriptome sequencing. The aim of this project is to provide a scientific basis for the anti-tumor research of both steroid alkaloids from Solanum lyratum and other saponins.

肿瘤外泌体已成为肿瘤研究的前沿和热点，肿瘤细胞及其外泌体膜富含胆固醇，申请人前期大量研究基础证明，白英甾体生物碱具有与皂苷类药物和胆固醇作用的相同性质，能够直接凝集脂筏胆固醇，发挥抑制肿瘤血管新生的抗肿瘤药效。故本项目创新性提出，白英甾体生物碱通过凝集肿瘤细胞和/或外泌体膜脂筏胆固醇，调控肿瘤外泌体生成，抑制外泌体与肿瘤微环境基质细胞相互作用，影响肿瘤外泌体功能的全新抗肿瘤机制假说。本申请课题拟采用体内及体外模型，结合透射电子显微镜、免疫荧光双标法、RNA-seq转录组测序等分子生物学实验技术，揭示白英甾体生物碱凝集脂筏胆固醇调控肿瘤外泌体生成及功能，从而发挥抗肿瘤耐药和抑制肿瘤血管新生，以及肿瘤免疫逃逸等抗肿瘤作用，并阐明其分子作用机制。本项目旨在为白英甾体生物碱的抗肿瘤研究提供科学依据，并基于皂苷类药物具有与胆固醇作用的特性，揭示皂苷类药物的抗肿瘤根本机制。

肿瘤来源外泌体(Tumor-derived exosomes，TEXs)可促进肿瘤的侵袭、转移、血管新生和免疫逃逸等，是肿瘤领域的研究热点。中药白英 (Solanum lyratum Thunb. )能清热解毒和利湿消肿，在临床上被广泛用于治疗各种肿瘤。白英总生物碱(total alkaloids from Solanum lyratum，TAS)具有显著的抗治疗非小细胞癌（NSCLC）作用；TAS能够凝集肿瘤血管内皮细胞细胞膜脂筏胆固醇、干扰脂筏形态及功能。本项目从凝集脂筏胆固醇抑制肿瘤外泌体生成和影响其功能的角度对TAS的抗肿瘤作用、安全性及其物质基础进行研究。.主要研究结果：① TAS大、小极性部位均可抑制小鼠S180移植瘤的生长，提高荷瘤小鼠免疫功能。Beagle犬39周重复给药实验表明TAS具有良好安全性。② 采用试剂盒及差速离心法获得A549细胞外泌体电镜下呈现圆形或椭圆形双层膜结构，粒径集中分布于100nm左右，表达外泌体特征性蛋白CD9、CD63。A549细胞来源TEXs可促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）血管新生。给予TAS及相关单体生物碱进行干预，结果表明TAS、SA1的干预明显抑制HUVECs管腔形成；能够显著促进A549外泌体分泌量，破坏外泌体完整性，其作用机制与其能够改变A549细胞TEXs蛋白质组表达有关。SA1预外泌体组肿瘤体积和瘤重均显著降低。③ GS2具有抑制A549细胞增殖、迁移、侵袭及粘附作用，这些作用可能与下调JAK2-STAT3通路相关蛋白表达相关。④ MS900明显抑制由外泌体诱导的A549细胞的增殖与迁移，其作用可能与降低甘油三酯水平相关。⑤分离鉴定35种甾体糖苷生物碱，其中新化合物28个。.本课题初步阐明TAS通过凝集脂筏胆固醇抑制肿瘤外泌体生成的作用机理，完成TAS的安全性评价，探明其功效物质基础，为后续研发和临床应用提供依据。.