磷酸化和去磷酸化对木榄细胞膜Na+/H+逆转运蛋白功能的调节

The Na+/H+ antiporter SOS1 is the only Na+ efflux protein at the plasma membrane of plants characterized so far, so it may play an important role in the plant tolerance to salinity. As a strong halophyte, the roots of Bruguiera gymnorhiza can exclude 99% salts, indicating that the Na+ efflux proteins at plasma membrane may function very well, so it should be a perfect plant to study the function of SOS1. The full length of the gene of Bruguiera gymnorhiza SOS1 (BgSOS1) has been cloned in our laboratory, its function has simply been studied, but also the new phosphorylation site in its squenece has been discovered. Based on our research work about BgSOS1 and taking into account my research experiences with Na+ transporters in other plants, we are studying the regulation of phosphorylation by SOS2-SOS3 protein kinase complex and dephosphorylation by 2C-type protein phosphatase (PP2C) on Na+/H+ antiport function of BgSOS1, and shall further identify its phosphorylation site and dephosphorylation site. In addition, we shall screen hyperactive SOS1 mutant gene by studying function inhibition domain in the sequence of BgSOS1. These will be helpful to elucidate the tolerance mechanism of plants to salinity and offer candidate genes to cultivate salt tolerant corps.

SOS1负责Na+/H+反向运输，是至今发现的细胞膜上唯一能把Na+从细胞内运输到细胞外的蛋白质。木榄是一种盐生植物，具有很强的耐盐能力，其根部能把吸收到体内99%的盐分再排出体外，这说明其质膜上的Na+外向运输蛋白具有很强的活性，因此木榄应该是研究植物SOS1蛋白功能的绝好材料。我们根据木榄BgSOS1的序列信息从木榄中克隆到了全长的BgSOS1基因，在初步研究了它的功能，并发现BgSOS1序列上新磷酸化位点的基础上，现在正利用相应的酵母和拟南芥突变体以及纯化BgSOS1蛋白，人工蛋白脂质体和蛋白磷酸化技术研究SOS2-SOS3蛋白激酶复合体和2C-型蛋白磷酸酶通过磷酸化和去磷酸化对BgSOS1功能的调节，再进一步鉴定BgSOS1序列上的磷酸化和去磷酸化位点，研究它的自身功能抑制区，筛选出耐盐性较高的BgSOS1突变基因，为探讨植物的耐盐机理提供理论证据和为培育较强耐盐性的作物提供材料。

Ca2+是生物体内重要的信使物质，能把外部的刺激信号传递给生物细胞，调节生物体对外界环境变化的反应。我们创新性地发现了酵母细胞膜Ca2+/H+逆向运输蛋白，为研究生物细胞维持Ca2+平衡提供了新的机理。CBL-CIPK作为一种重要的Ca2+信号系统，与植物对非生物逆境应答关系密切。盐胁迫条件下，拟南芥CBL4和CBL10都能感知细胞内Ca2+浓度的变化，结合Ca2+的CBL4和CBL10能分别与蛋白激酶AtCIPK24互作形成蛋白激酶复合物，进一步通过使一个丝氨酸残基磷酸化激活细胞膜Na+/H+逆向运输蛋白SOS1外排Na+的功能，进而调节拟南芥的耐盐性。我们通过研究木榄细胞膜Na+/H+逆向运输蛋白SOS1（BgSOS1）结构与功能的关系发现单独SOS2就可以磷酸化调节木榄SOS1的活性，并且还可以和两个丝氨酸残基结合；SOS2和SOS3互作形成的蛋白激酶复合体可以通过另外一个调节位点调控BgSOS1外排Na+的功能，并且SOS2与SOS2-SOS3复合体调节BgSOS1活性的效果是可以叠加的。除CBL4和CBL10外， 另一个分布在细胞膜上的CBL8也能和CIPK24互作形成蛋白激酶复合体，通过使SOS1磷酸化激活SOS1的Na+/H+逆向运输活性。因为正常条件下SOS1处于非活性状态，所以磷酸化激活的SOS1应该可以通过去磷酸化恢复到非活性状态。本项目研究发现两个PP2C型蛋白磷酸酶ABI2和HAB1能通过去磷酸化降低SOS1运输Na+的活性。...我们利用酵母研究SOS1和AHA1的协调作用发现SOS1能直接利用AHA1产生的H+梯度更高效地外排细胞内的Na+，所以两个基因共表达酵母的耐盐性显著增强。这个结果验证了SOS1可利用细胞膜H+-ATPase AHA分解ATP形成的跨细胞膜H+梯度把细胞内过量的Na+运到细胞外，从而提高植物耐盐性的机理。钙信号蛋白CBL10可通过与AHA4和AHA11互作调节细胞膜H+-ATPase的活性，所以也能间接地调控细胞膜Na+/H+逆向运输蛋白SOS1运输Na+的功能。..由于C末端存在功能抑制区，所以如不受SOS2-SOS3复合体调节，SOS1处于非活性状态。通过修饰小麦SOS1的抑制区，得到一个不需要SOS2/SOS3调控就能高水平运输Na+的超活性突变SOS1，相应的突变SOS1能显著增强转基因植物的抗盐性。