木薯细胞膜硝酸盐运输蛋白功能调控机理

As a pioneering crop, cassava grows in infertile soil very well, suggesting that the plant can uptake and utilize nutrient elements from the soil efficiently, so it should be a perfect plant to study the nutrient uptake. However, little is known about the mechanism of nutrient uptake of the plant, especially it is not clear how the plant uptake NO3- from the soil. Based on our research work about the response of cassava to nitrogen dificiency and taking into account my recent research experiences with ionic transporters in the plants, we have been cloning the genes of cassava nitrate transporters (NRTs) which are very important for the plant to uptake nitrogen element from the soil, and shall study their expressions in cassava under nitrate dificiency. We shall study their functions of NO3-/H+ symport with yeast mutant, Arabidopsis mutant and artificial proteoliposomes, and investigate the regulation of CBL-CIPK pathway on NO3-/H+ symport activity of cassava NRTs. In addition, we shall screen hyperactive NRT mutant genes by studying auto-inhibitory domain in the sequence of cassava NRTs. Finally the function of NRT will be studied in cassava. These will be helpful to elucidate the tolerance mechanism of cassava to infertility and offer candidate genes to cultivate infertile tolerant cassava.

木薯具有突出的养分利用效率，说明木薯可能具有很高的氮吸收和利用效率。但有关木薯氮营养的研究较少，特别是木薯如何在低氮条件下高效吸收硝态氮的机制并不清楚。本课题从木薯中克隆一些重要的硝酸盐转运蛋白基因（NRTs），研究硝酸盐胁迫条件下它们在木薯中的表达模式；用荧光共聚焦显微镜技术研究这些NRT蛋白的细胞定位；利用相应的酵母和拟南芥突变体以及人工蛋白脂质体在生理、生化和分子生物学水平上研究这些硝酸盐转运蛋白的功能，筛选出硝酸盐吸收效率最强的NRT；进一步研究CBL-CIPK信号途径调节相应NRT蛋白的活性；分析木薯NRT蛋白结构和功能的关系，鉴定其序列上的自身功能抑制区，筛选出高活性的木薯硝酸盐转运蛋白突变基因；利用CRISPR/Cas9技术抑制那些氮高效吸收的硝酸盐转运蛋白基因在木薯中的表达，或者把它们转进木薯中，利用基因沉默或者基因超表达技术，在木薯中研究NRT对木薯耐贫瘠性的影响。

木薯在很低的氮水平（0.15 mM (NH4)NO3）下生长的比在正常条件下更好，这说明木薯耐低氮能力很强。进一步研究发现很低的NH4+水平(0.15 mM)即可满足木薯生长所需；但一定范围(0.01-3 mM)内随着NO3-浓度升高，木薯生长越来越好。这些结果不但解释了木薯氮营养高效的特征，也为木薯田间施肥提供了参考。.植物主要通过高亲和性硝酸盐运输蛋白(NRT2s)吸收硝态氮。木薯中含有6个MeNRT2s基因，它们的表达都受低硝态氮胁迫诱导。超表达MeNRTs基因可通过提高低硝酸盐胁迫条件下转基因植物体内的硝酸盐、蛋白质和总氮的含量，促进其生长。这些都证明了MeNRT2s与植物硝酸盐的吸收密切相关。.木薯中有8个CBL和25个CIPK蛋白，它们可通过相互作用形成一些CBL-CIPKs信号系统帮助木薯感受盐、干旱、高温、低温和营养缺乏等非生物胁。其中MeCIPK10通过使MeAKT1磷酸化调节其运输钾离子的能力从低亲和性向高亲和性转变，进而调控木薯高效吸收钾离子的能力。在低氮胁迫条件下，一些木薯CIPKs和MeNRT2基因表达发生明显变化，并且其中一些MeCIPKs可分别与MeNRT2.5互作调节其运输硝酸盐的功能。盐胁迫条件下，CBL10能与蛋白激酶CIPK8互作形成蛋白激酶复合物，进一步通过磷酸化激活细胞膜Na/H逆向运输蛋白SOS1外排Na+的功能，进而在地上部分调节植物耐盐性。.蔗糖合酶是植物淀粉积累过程中的关键酶。本研究发现木薯的一个蔗糖合酶基因MeSus1可能与其淀粉合成关系更加密切。进一步研究发现一些转录调控因子可通过调节MeSus1的表达进而调控木薯的淀粉合成，为研究木薯淀粉高效积累的机理奠定了基础。.我们利用转基因拟南芥研究SOS1和AHA1的协调作用发现SOS1能直接利用AHA1产生的H+梯度更高效地外排细胞内的Na+，所以两个基因共表达的转基因植物的耐盐性显著增强。这个结果首次在遗传学上验证了SOS1可利用细胞膜H+-ATPase AHA分解ATP形成的跨细胞膜H+梯度把细胞内过量的Na+运到细胞外，从而提高植物耐盐性的机理。.在以上研究植物营养高效和耐盐性机理基础上，利用耐盐作物和特殊栽培措施改良国内外的盐碱地已取得了显著的经济效益和社会影响。