TALENs基因打靶技术和2A序列介导多基因协同表达技术制作皮肤移植模型猪的研究

Immunological rejection of xenotransplantation is a complex, multicomponent, interactive process. As the efficiency for us to produce knockout animals is extremely low by traditional technology, the previous researchers modifys xenotransplantation donor with single or two gene or to one kind of immunological rejection. There are restrictions and limitations to evaluate and monitor the immunological rejection on this account. Meanwhile the porcine organ used for clinical in any real sense are required multi-transgenic modification. This project, on the base of operation platform of effcient?α1，3GT knockout technology, was to produce skin graft models of porcine by TALENs technology and the multi-transgenic coordinate expressin technology via 2A petide. This study will produce ?α1,3-GT gene knockout pigs of Banna Minipig Inbred Line with transfer human genes related to immunological rejection and expressed special in skin. The anti-rejection effect will comprehensively evaluate by biological compatibility of pig skin with non-human primates' and the status of transplant receptor. The superior programmes of transgenic modification were selected. The research will set a basis for us to develop skin graft research and evaluate immunological rejection. Meanwhile, it was of great significance to develop humanize organ, xenogeneic donors, model animals and facilitate the biomedical research development as well.

异种器官移植免疫排斥是复杂且多环节的过程。由于传统基因打靶效率极其低，先前的研究均是对器官移植供体进行1或2个基因修饰或针对某一种免疫排斥反应的研究，以此评价监测免疫排斥反应具有局限性。而猪的器官真正意义上用于临床治疗，同样需要对猪的基因组进行多种修饰和改造。本项目在已高效获得α1，3GT基因敲除的研究基础上，利用TALENs基因打靶技术和2A序列介导多基因协同表达技术，对特有的版纳微型猪近交系α1，3GT基因敲除，同时组合转入多种与免疫排斥相关基因，并在皮肤组织中协同靶向表达，构建皮肤移植猪模型。通过检测不同基因改造后的猪皮肤与非人类灵长类组织的生物相容性，移植后受者免疫状态，综合评价抗免疫排斥的效果，筛选最佳皮肤移植供体基因修饰方案。本模型不仅可用于皮肤移植研究，而且建立起一套免疫排斥反应评价方法，对人源化器官生产，异种器官移植，模式动物研究具有重要意义，将促进生物医学发展。

项目实施中，高效率获得了a 1，3GT基因敲除细胞系，TALENs Set1#打靶效率高达89.5%（187/209），且有27.8%（58/209）的细胞克隆是双敲；构建了 a1，3GT基因敲除母猪，获得了3头 a 1，3GT基因双敲除的雌性小型猪。经检测3头猪的细胞表面 a 1，3GT半乳糖基表位完全缺失；构建了 a 1，3GT基因敲除公猪；紧扣基因编辑技术发展前沿，利用改造后的Cas9-nickase系统，选择编码酪氨酸酶的TYR基因，进行基因敲除操作，通过对PFFs转染一对gRNA质粒和Cas9n质粒获得了15头具有典型白化表型特征的基因敲除猪模型；调取了6种免疫排斥相关基因（CD55/CD59/CD46/hHLA-G/CD47/CTLA4），构建了载体；总结了项目中基因敲除技术和体细胞核移植技术的研究进展。. 项目主持人以第一作者将研究成果发表在CMLS（Cellular and Molecular Life Sciences）杂志（影响因子5.68，引用次数：116）；发表中文核心期刊论文4篇、会议论文1篇；授权发明专利1项，排名第二。2人晋升副高职称（信吉阁，成文敏）， 1人入选校“百名”青年学术和技术带头人培养计划（信吉阁）， 2人遴选为硕士生导师（信吉阁，成文敏），1人入选2016年度“红云园丁奖”先进教师（信吉阁）。培养博士研究生1人、硕士研究生2人，本科生16人完成本科毕业论文。