桩蛋白通过VEGF-A/FAK/PXN通路对角膜新生血管生成中的调控机制研究

A crucial difficult problem the ophthalmology field has to be faced with nowadays is that the CNV (corneal neovascularization) induced by multi-ophthalmic diseases may ultimately lead to blindness. However, the molecular mechanism that resulted in the CNV is not clear yet. PXN (paxillin) plays a pivotal role in a variety of signaling pathways that regulating cell adhesion and movement. It is the necessary part in the progression of the formation of CNV and tumor. ..Researches from our project team and German AE etc have all showed that the PXN expression has been regulated by the cellular micro-environment and been mediated by different signal pathways when it enhance or weaken the function of HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) form blood vessel.Keratitis, one of the common ophthalmic diseases, will often result in CNV, but it is remain unknown on the variation of signal pathway that mediated by the PXN. ..In order to find out the signal pathway mediated by PXN, by adopting both of the prototype of the formation of HUVEC, CNV on the white mice and the tool of analyses on the whole genome expression and protein interaction proteomics, this project will explore the variations on the both of the expressions of regulating PXN and the signal pathway regulated by PXN, and the variation on the proteomic that interacted with the PXN, when forming the CNV...Our researches will shed light on PXN’s function played in the formation mechanism of CNV and this will provide the treatment of CNV with an effective theoretical basis and target.

多种眼科疾病引起的角膜新生血管形成并最终导致失明已成为目前眼科界面临的重要难题，然而角膜新生血管形成的分子机制还不清楚。信号传导“中转站”PXN（桩蛋白）可介导多种信号通路，调控细胞黏附与运动，是肿瘤和角膜新生血管生成必需分子。本课题组与German AE等的研究表明PXN表达在增强或减弱人脐静脉内皮细胞（HUVEC）形成血管的作用受细胞微环境的调控，经由不同信号通路介导。常见眼科疾病角膜炎常常引起新生血管的形成，而其中PXN介导的信号通路变化尚不清楚。本项目拟采用HUVEC和小鼠角膜新生血管形成模型以及全基因组表达和蛋白互作组学分析，来探讨角膜新生血管形成过程中调控PXN的和PXN调控的信号通路分子的表达水平变化以及与PXN相互作用的蛋白质组变化，明确其中由PXN介导的信号通路。我们的发现将揭示PXN在角膜新生血管形成的机制中的作用，为治疗角膜新生血管提供有效的理论基础与靶点。

目的：桩蛋白（PXN）是粘着斑的关键成分，在血管生成中起重要作用。本研究的目的是研究 PXN 在血管内皮生长因子 A (VEGF-A) 诱导的人脐静脉内皮细胞 (HUVECs) 血管生成中的作用。..方法：过表达PXN和PXN干扰载体转染HUVEC，生化检测用于检测三磷酸腺苷和乳酸的产生，电镜下观察线粒体形态，流式细胞仪检测线粒体膜电位，Transwell实验用于检测各组细胞的迁移和成管能力，通过蛋白质印迹评估己糖激酶 (HK)1、HK2、葡萄糖转运蛋白 1 (GLUT1)、磷酸化磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K)、磷酸化 AKT 和磷酸化雷帕霉素机制靶标 (mTOR) 的表达。..结果：在 VEGF-A 诱导的 HUVEC 中，PXN 沉默降低了乳酸和三磷酸腺苷的水平，下调了 HK1、HK2 和 GLUT1，抑制了 PI3K/AKT/mTOR 信号传导的激活，并抑制了 VEGF-A 诱导的线粒体损伤。我们还确定 miR-145-5p 降低 VEGF-A 诱导的 PXN 表达并抑制 HUVEC 的侵袭和血管生成。此外，miR-145-5p 抑制阻断了 PXN 干扰对 VEGF-A 诱导的 HUVEC 损伤的保护作用。此外，PXN 沉默降低了 VEGF-A 处理的小鼠角膜中乳酸和三磷酸腺苷水平，抑制了 PI3K/AKT/mTOR 活化，和降低了HK1、HK2 和 GLUT1 的水平。..结论：结果表明，PXN 沉默通过调节细胞代谢和线粒体损伤来抑制 VEGF-A 诱导的 HUVECs 侵袭和血管生成，表明 PXN 可能是抗血管生成治疗的潜在靶点。