DDRs与整合素-FAK信号通路对脉络膜新生血管的协同调控作用

近来研究及本研究组既往工作证实，除了血管生成因子外，细胞外基质(ECM)和ECM受体也参与重要致盲眼病- - 脉络膜新生血管(CNV)的生成。但CNV生成过程中ECM受体信号转导机制、视网膜色素上皮(RPE)细胞与ECM相互作用、传递信号参与CNV生成调控的机制尚不明。本项目拟研究CNV生成过程中，缺氧、衰老等多种影响因素是否可以启动RPE细胞盘状结构域受体(DDRs)的表达，通过协同作用调控RPE细胞整合素-黏着斑激酶(FAK)信号，激活胞内信号转导途径及下游转录因子表达，通过可溶性细胞因子影响RPE-脉络膜微血管内皮细胞(CEC)之间的相互作用、调控CEC的增生、移行及管腔形成等生物学行为，参与CNV的发生和发展。利用病毒转染、三维细胞共培养和双荧光素酶报告基因检测等技术，从新的角度探讨ECM受体信号在CNV生成过程中的协同调控作用及分子机制，为临床防治CNV相关疾病提供新的思路。

为明确DDR2与FAK信号通路是否在CNV发生中发挥协同的调控作用，其具体的作用机制如何。本项目运用RPE- CEC体外共培养和DDR2自发突变小鼠CNV动物模型，采用RNA干扰技术、贴壁细胞共培养技术、动物实验及腺病毒载体玻璃体腔注射等方法，证实了在CNV发生的早期，活化的RPE细胞内FAK表达上调；氧化衰老、POS代谢产物的堆积以及RPE与ECM的接触等，均可不同程度上调RPE细胞内FAK的表达；成功构建了pSilencer/FAK表达载体，可有效下调RPE细胞FAK的表达，对于缺氧诱导的RPE细胞HIF-1α、VEGF的高表达有显著的抑制作用；成功原代培养牛CEC细胞，观察到RPE细胞与CEC共培养可以刺激CEC的增生和移行，缺氧条件下刺激作用增强。而FAK表达下调的RPE细胞与CEC共培养，其诱导CEC增生和移行的能力减弱。. 正常RPE细胞存在DDR2表达，缺氧状态下DDR2表达减弱，运用Ｉ型胶原刺激RPE细胞DDR2的表达后，可以抑制缺氧诱导的RPE细胞HIF-1α和VEGF的表达；在CNV发生的早期DDR2表达减弱，而DDR2自发突变小鼠激光光凝后 CNV生成严重程度增加；利用siRNA与Ad DDR2腺病毒玻璃体腔注射下调及上调DDR2的表达观察CNV生成的各项指标，进一步证实DDR2表达缺失可刺激 CNV的生成。. DDR2-/-小鼠激光光凝后pFAK的表达较DDR2+/+组明显增加，提示DDR2的缺失能够激活pFAK的表达，刺激CNV的生成。DDR2-/-组小鼠玻璃体腔注射FAK siRNA后，可以进一步加重激光诱导的CNV严重程度，提示DDR2与FAK在CNV生成过程中存在协同调控作用。. 初步探索了FAK协同DDR2信号通路影响CNV的生成的信号转导机制。CNV生成过程中，DDR2缺失可以上调HIF1-α、VEGF的表达，同时上调Tie2和Ang2的表达；DDR2可能通过抑制PI3K通路关键激酶的磷酸化，发挥抗新生血管生成的作用。从新的角度探讨ECM受体信号在CNV生成过程中的协同调控作用，为临床防治CNV相关疾病奠定了实验基础。