Ca2+-mTOR通路介导的雪旺细胞自噬在电刺激治疗周围神经损伤中的作用及其机制研究

Schwann cell (SC) can promote the regeneration of axons, which is a key factor in the process of repair of peripheral nerve injury(PNI). However, the function of SC is limited by the decrease of cell viability and apoptosis during the process of repair. Studies have showed that autophagy is possibly an important method for SC to maintain the function and vitality，but the detailed mechanism is still unclear. In the preliminary experiment, We have found that electronic stimulation(ES) can accelerate repair of PNI in the PNI-rat model which was set in the former study. In addition, we found that ES induced autophagy in SC and stimulates Ca2+ influx. So we assumed that ES can induce the autophagy of SC by the Ca2+-mTOR pathway in repairing PNI. In this study: 1) detect the potential molecular mechanism in autophagy of SC，investigate the detailed mechanism of ES inducing SC autophagy; 2) establish a model of PNI and investigate the mechanism of ES inducing SC autophagy in vivo，and study the function of ES in nerve and muscles controlled by the nerve. Our study will help in understanding the PNI and in finding the scientific evidence and new target in curing PNI with ES.

雪旺细胞（SC)可促进神经元轴突再生,是周围神经损伤后修复的关键因素之一，但周围神经损伤后SC生物学活性下降并发生凋亡限制了其功能。研究发现自噬是细胞在应激下保持生物学活性的重要代偿机制，但其在SC中的作用及机制仍然未知。在前一项面上基金研究中，我们建立了周围神经损伤模型，发现电刺激可促进周围神经损伤的修复,更重要的是电刺激可诱导SC自噬并促进Ca2+内流。基于此，我们假设电刺激调控Ca2+-mTOR通路激活SC自噬，提高SC生物活性并防止凋亡，从而促进周围神经损伤后的修复。本课题1）通过高通量检测分析介导SC自噬激活的潜在分子和信号通路，探讨电刺激下SC自噬的作用及分子机制；2）动物模型进一步验证电刺激激活SC自噬及具体机制，并通过调节体内自噬水平分析其对周围神经及其靶器官的作用。本项目一旦完成将加深对周围神经损伤修复再生机制的认识，还为电刺激治疗周围神经损伤的策略提供科学依据和新靶点。

雪旺细胞是周围神经损伤后促进修复的关键细胞，低频电刺激可以促进周围神经的再生，但是其修复神经的具体作用机理至今尚未明了。自噬可以防止细胞死亡，提高细胞的活力和功能，雪旺细胞自噬是周围神经损伤后髓鞘清除的重要机制，诱导雪旺细胞自噬可以促进神经再生。因此，我们假设：低频电刺激是通过激活雪旺细胞的自噬，进而提高和维持雪旺细胞促进神经修复的能力，最终改善周围神经损伤后的恢复效果。基于以上研究假设，本课题通过以下两部分展开研究。.第一部分：体外实验。通过对体外培养的雪旺细胞行低频电刺激，流式细胞术检测细胞凋亡率，活死细胞染色观察细胞存活情况，CCK-8实验检测细胞活力，发现适宜参数的低频电刺激不引起雪旺细胞凋亡，可提高雪旺细胞的活力。用一定参数的电刺激干预雪旺细胞后，通过Western blot检测自噬相关蛋白的表达，雪旺细胞转染mRFP-GFP-LC3腺病毒后，荧光显微镜下观察自噬体与自噬溶酶体的转变，发现低频电刺激可使雪旺细胞自噬流活化。.第二部分：体内实验。建立大鼠坐骨神经损伤模型，对腓肠肌行低频电刺激，步行足迹分析、靶肌肉H-E染色发现低频电刺激可加速运动功能恢复；电生理检测及形态计量学分析表明低频电刺激可促进神经再生；透射电镜、Western blot、免疫荧光染色分析发现低频电刺激提高了损伤远端神经组织内的自噬水平；药物抑制自噬减缓了运动功能的恢复和神经的再生。体内实验表明：周围神经损伤后低频电刺激可能是通过提高雪旺细胞的自噬水平从而加速功能恢复与神经再生。.总之，本研究从细胞层面和动物层面均证实低频电刺激可提高雪旺细胞的自噬水平，为深入理解低频电刺激的作用机制提供了新的思路，为电刺激治疗周围神经损伤提供了科学依据和新靶点。