KLF4调控CRMP-2转录抑制视网膜神经节细胞轴突生长的分子机制及作用研究

自身再生潜能低下是哺乳动物视神经再生受限的重要原因。最新研究发现核转录因子KLF4是制约视网膜神经节细胞(RGCs)内在再生潜能的关键因素之一，但其作用机制不明。我们前期发现在RGCs中,应用KLF4激活剂和阻断措施可分别诱导CRMP-2 mRNA和蛋白表达下调和上调，且生物信息学分析CRMP-2启动子上游调控区存在KLF4可能结合位点，故推测KLF4可通过调控CRMP-2转录进而发挥RGCs轴突生长抑制作用。本项目拟采用染色质免疫共沉淀和基因突变等方法筛选KLF4调控CRMP-2转录启动子活性的结合位点, 应用RNA干扰等技术探讨KLF4可通过调控CRMP-2转录从而抑制RGCs轴突生长的作用机制，并结合既往研究基础，观察体内阻断KLF4并联合阻断抑制因子NgR对于损伤视神经是否有更强的促再生作用，为探索高效地促视神经再生的治疗策略，并开发治疗视神经损伤的基因药物提供实验依据。

本研究立足于文献结论KLF4对于RGCs轴突生长具有抑制效应的基础上（Science.2009;326(5950):298-301），假说KLF4负向调控CRMP-2转录抑制RGCs轴突生长。为验证此假说，我们首先证实了CRMP-2在大鼠视神经存在表达，观察了正、负调控CRMP-2表达对于RGCs轴突生长的影响，明确了CRMP-2对于RGCs生长的促进作用，构建了KLF4表达质粒和CRMP-2启动子区荧光素酶报告质粒载体，通过荧光素酶报告活性分析，证实KLF4核转录因子对CRMP2启动子转录有激活作用，通过生物信息学分析预测了KLF4对于CRMP-2启动子区的可能结合位点并进行了基因突变分析，确定了KLF4调控CRMP-2启动子的可能区域，采用染色质免疫共沉淀（chip-PCR）方法进一步证实了KLF4和CRMP-2体内存在直接关联，但我们的KLF4过、低表达实验发现KLF4对于CRMP-2的mRNA和蛋白水平的表达调控呈正相关性，这与我们的假说KLF4负向调控CRMP-2转录不相一致，结合最近文献（Nat Commun,2013,4:26-33），KLF4通过结合STAT3并将其磷酸化，抑制JAK-STAT3信号通路，从而抑制RGCs轴突生长，提示KLF4—JAK-STAT3—CRMP-2间可能存在信号关联。此外，在验证CRMP-2在视神经损伤中的修复作用时，我们进行了视神经损伤后CRMP-2总蛋白、磷酸化修饰蛋白及调控其磷酸化修饰的关键蛋白激酶检测，发现CRMP-2总蛋白的表达变化并不显著，而磷酸化CRMP-2变化明显，且调控CRMP-2磷酸化修饰的关键蛋白—CDK-5表达也显著上调，提示视神经损伤后CRMP-2的磷酸化修饰可能也是制约其修复的重要因素，这些值得进一步研究。.本研究已按计划完成课题内容（部分调整项目见原因说明），培养研究生2名，暂未发表SCI论文。