玉米大斑病菌调控基因StMR1与DHN黑色素合成关系研究

本实验室通过创制玉米大斑病菌黑色素缺失突变体并结合药物学实验首次明确了该病菌能够代谢产生DHN黑色素，且黑色素与病菌的侵染效能密切相关。目前，已成功克隆了黑色素合成途径中的5个关键酶基因（StPKS、StSCD、St3HNR、St4HNR、StLAC1）和一个编码转录因子的基因StMR1。本项目拟通过基因敲除、回复突变等方法获得StMR1基因的突变体，采用PCR、Southern blot、Real-time PCR、Northern blot等技术深入研究StMR1基因对黑色素合成酶基因的调控能力，结合染色质免疫沉淀技术（ChIP）和绿色荧光蛋白定位技术深入研究转录因子的调控机制，阐明该基因与黑色素合成的关系。明确StMR1基因的功能以及该基因编码的转录因子在玉米大斑病菌黑色素合成途径中的调控机制，将为深入研究该病菌的侵染机理、开发新型杀真菌制剂奠定理论基础。

本研究对玉米大斑病菌黑色素代谢途径的6个合成酶基因（StPKS、StSCD、St3HNR、St4HNR、StLAC1、StLAC2）和1个编码转录因子的基因StMR1进行了病菌不同发育时期、侵染过程的表达量分析，初步明确了表达模式，利用生物信息学方法对转录因子的功能和调控区域进行了预测分析，进而利用基因敲除、RNAi和超表达技术分析基因功能。通过分析突变体中转录因子与黑色素合成酶基因的表达规律，结合ChIP分析结果，确定了该转录因子调控黑色素代谢的位点，主要研究结果如下：1）StMR1基因位于基因组scaffold12负链的545611-550153位置，共编码1007个氨基酸，具有植物病原真菌转录因子特有的保守结构域；StPKS、StSCD、St3HNR和StLAC2基因在基因组中成簇排列，连锁在40.2kb范围内。2）7个基因在菌丝时期、分生孢子时期、病菌侵染过程中均有表达，且表达量有显著差异；菌丝时期StMR1基因与StLAC1、StLAC2、StPKS基因的表达量相近；分生孢子时期StMR1基因与StLAC1、St4HNR基因的表达量相近；病菌侵入寄主过程中StMR1与StPKS和StLAC1基因表达规律一致。3）通过PEG介导的原生质体转化，获得了1个StMR1基因缺失突变体、5个RNAi沉默转化子、3个目的基因超表达突变体，对突变体分析结果表明，StMR1基因在玉米大斑病菌黑色素生成、菌丝生长发育、分生孢子产生和形态等方面具有重要作用。4）对沉默转化子和突变体进行基因表达量分析，StMR1基因缺失或沉默后，StPKS、St3HNR、St4HNR、StLAC1和StLAC2基因的表达均有下调；StMR1基因超表达突变体中St3HNR和StLAC2基因表达量明显增加，说明StMR1基因通过调控聚酮体合成酶、还原酶、漆酶基因的表达影响黑色素合成。5）GFP亚细胞定位检测结果显示，新菌丝中荧光信号较强，而在分生孢子、附着胞、侵入钉时期的荧光较弱，说明StMR1基因的编码产物主要在新菌丝中表达。6）染色质免疫共沉淀结果显示，Stmr1p直接与StPKS、StLAC1、StLAC2、St3HNR启动子结合，调控合成酶基因的表达。7）成功构建了玉米大斑病菌酵母双杂交cDNA文库。以上结果为深入研究玉米大斑病菌的致病机制、开发新型杀菌剂奠定了基础。