棉花黄萎菌黑色素合成途径相关基因的克隆及功能分析

黄萎病是棉花生产上最具毁灭性的一种土传病害，主要以微菌核在土壤中长期存活，萌发侵染。本项目拟对微菌核具有保护作用的黑色素作为突破口，通过农杆菌介导的遗传转化方法，筛选黑色素形成异常的突变体；通过TAIL-PCR进行染色体步移，获得T-DNA插入位点的侧翼序列，并对突变基因进行全基因组的克隆和测序；通过基因的遗传互补和超表达，明确黑色素合成途径中的相关基因；通过黑色素合成相关基因编码蛋白的亚细胞定位、表达谱研究，分析棉花黄萎菌黑色素合成途径中相关基因表达的生物学意义；通过突变体致病性和生物学性状的测定，明确黑色素与棉花黄萎菌致病力之间的关系及黑色素对棉花黄萎菌的影响。本项目的开展有助于解析棉花黄萎菌黑色素合成途径的分子机制、黑色素与微菌核对黄萎菌致病力的影响，为全面解析棉花黄萎菌的致病机理、与寄主的互作关系、探索新型杀真菌制剂奠定基础，为开辟新途径防治棉花黄萎病提供理论依据。

由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的黄萎病是棉花生产上最具毁灭性的一种土传病害。由于该病原主要以黑色微菌核在土壤中长期存活，萌发侵染，是棉花黄萎病的初侵染源。本项目主要针对黑色素合成途径中的相关基因及其生物学功能进行研究，以探索黑色素合成途径是否与病原物生长发育、菌核形成及致病性相关。研究结果如下：以新疆棉花黄萎病落叶型强致病力菌株V592为材料，利用农杆菌介导的遗传转化（ATMT）技术构建了一个含15000个转化子的T-DNA插入突变体库，从中筛选黑色素形成异常的突变体，初步获得10个基因由于T-DNA插入突变引起黑色素形成异常。利用同源重组原理获得针对4个目标基因（VdMPRC1、VdHP、VdPKS和VdSge1）的敲除突变体，与野生型菌株V592为对照，VdMPRC1、VdHP和VdPKS基因的敲除导致突变体产生的微菌核都没有黑色素沉积，对棉花的致病力明显下降，说明这3个基因是大丽轮枝菌黑色素合成途径中的关键基因，并与致病性密切相关。VdHP基因的敲除导致产孢量明显升高，VdPKS基因敲除导致产孢量明显下降，VdMPRC1基因敲除对产孢量没有影响，说明VdHP基因和VdPKS基因参与病原物生长发育。3个基因在野生型菌株V592中均具有组织表达特异性，都不在分生孢子中表达，VdMPRC1和VdHP基因在菌核和菌丝中表达，VdPKS基因只在菌核中表达，说明微菌核是黑色素沉积的主要载体。VdSge1基因敲除导致突变体菌落生长速度、产孢量明显高于野生型菌株，丧失对棉花的致病性，但不影响黑色微菌核的产生，说明VdSge1基因不是大丽轮枝菌黑色素合成途径中的必需基因，但是致病所需的关键基因，并参与病原物生长发育。因此，本研究结果说明大丽轮枝菌黑色素合成与微菌核形成是2个独立的合成途径，其中与黑色素合成相关的关键基因参与病原物致病过程。该研究结果为进一步揭示棉花黄萎病菌致病的分子机理及探索黄萎病防治新策略提供了重要的理论依据。