基于叶酸受体肿瘤特异性表达系统的肝癌实时靶向诊断与治疗研究

肝癌的早期筛查与实时监测是肝癌治疗的关键。目前对小肝癌诊断仍然很困难，急需探索新的诊断技术及其早期治疗手段。在前期构建的肝癌、胰腺癌和黑色素瘤特异性表达系统的基础上，本研究组拟应用分子克隆技术构建叶酸受体肝癌特异性表达系统；以腺相关病毒AAV为载体，在肝癌荷瘤小鼠肝癌组织中特异表达叶酸受体；以叶酸偶联纳米磁珠为示踪基团，在MRI下确定其肝癌诊断的灵敏度，建立新的MRI肝癌早期分子影像诊断技术。以放射性碘偶联叶酸作为配体结合MRI影像技术，针对叶酸受体-AAV干预的荷瘤小鼠，研究分子靶向的肿瘤内放疗的效果，建立从早期实时诊断到治疗的一体化分子影像与治疗体系。研究目的与意义：探索与建立新的肝癌早期诊断MRI技术以及无创性早期肝癌的治疗技术，为临床应用奠定实验基础。

【研究背景】肝癌的早期筛查是肝癌治疗的关键。影像学技术的发展为肝癌的早期诊断提供了良好的手段，尤其是MRI。但是应用MRI检测小于0.5 cm肝癌存在困难。肿瘤细胞纳米磁珠富集可以增加MRI检测灵敏度，提高对小肝癌的检测率。【研究内容】1.纳米磁珠偶联叶酸的化学构建与鉴定。2. HE染色或电镜下观察处理细胞磁珠叶酸富集变化；应用免疫组化和Western Bloting分别检测叶酸受体的细胞定位和表达量，证明叶酸受体对磁珠叶酸增加吸收功能。3. 构建AAV肿瘤特异性叶酸受体表达系统，以及稳转AAV肿瘤特异性叶酸受体表达系统的肝癌细胞系。4.合成新的纳米颗粒影像学诊断试剂。5. miR-302b、miR-214、miR-15b-5p在肝癌中的作用机制。【研究结果】1.成功构建纳米磁铁偶联叶酸颗粒（fluid MAG-fa），且该颗粒在浓度大于40mg/L时在HeLa细胞中的摄取量大于对照组（fluidmAG-Mine），其摄入机制为细胞内吞，且有明显的能量依赖机制。2. 体外MRI检测了fluid MAG-fa，fluidMAG-fa可以明显引起磁共振信号的阵低。3.成功构建表达叶酸受体（FR）的AAV载体，并感染HepG2，筛选稳转细胞系，称为EGFP/FR-HepG2。用western blot验证EGFP/FR-HepG2细胞中FR含量高于对照组。4.显微镜下观察处理细胞磁珠叶酸富集变化，结果显示：EGFP/FR- HepG2细胞胞质内存在蓝色铁颗粒，染色的深浅与所加SPIO-Fa复合物的剂量成正相关。体外MRI结果显示：HepG2-fr转染细胞叶酸纳米磁铁颗粒组MRI信号较其他各组降低明显，20mg/L信号组显著降低。5. 纳米颗粒GNa-Er@Nd可以在双波长793nm和980nm下激发上转换冷光（UCL），可以成为MRI、CT及UCL一种新的影像学检测试剂。5. miR-302b通过靶向AKT2、miR-214靶向E2F3、miR-15b-5p靶向Rab1A而实现对肝癌细胞的增殖抑制与诱导凋亡。【科学意义】1.纳米磁铁叶酸颗粒的构建结合肿瘤特异性表达叶酸受体慢病毒系统可以为肝癌早期MRI诊断奠定了理论与实践基础。2.肝癌中抑癌miRNAs的发现为肝癌的基因治疗提供理论依据。