新城疫病毒HN基因重组乳酸菌诱导DCs活化NK细胞杀伤肿瘤的分子机制研究

DCs could enhance the antitumor effect of via NK activating and also mediate innate immunity and adoptive immunity to resist the infection and tumor. We had confirmed that HN/Lab had good antitumor effect and activated NK in the past experiment, however,the molecular mechanism of NK killing tumor mediated by HN/Lab was not clear. Therefore, we plan to apply FCM，FQ-PCR ,ELISA technique to study the effect of HN/Lab induced DCs activating NK cell against tumor,illuminate the influence of NKG2D on the surface of NK mediated by DCs and the mechanmism of killing, reveal the activation of NK mediated by DCs through cytokine secreting and interaction in cells. The purpose is desired to lay foundation to study the molecular mechanism on NDV recombinant lactobacilli induced DCs activating NK against colon cancer.The aim is to lay foundation for crosstall between DCs and NK cell.

树突状细胞（Dendritic Cells,DCs）是介导固有免疫和获得性免疫的桥梁，对抗感染、抗肿瘤具有重要的调节作用，尤其是DCs能够增强NK细胞的抗肿瘤效应。本课题组经实验证实表达新城疫HN基因的重组乳酸菌（HN/Lab）具有较好的抗肿瘤效果，并能促进NK细胞的活化，但HN/Lab是如何介导NK细胞杀伤肿瘤细胞的分子免疫机制目前不清楚。本项目拟通过采用流式细胞术、荧光定量PCR及ELISA等技术对HN/Lab诱导DCs活化NK细胞的杀结肠癌作用、DC对NK细胞活化受体NKG2D的影响及其杀伤机制以及细胞因子分泌及细胞间分子接触对DC介导NK细胞活化的作用方面进行研究，以揭示HN/Lab诱导DCs活化NK细胞杀肿瘤的分子机制，旨在为DCs与NK之间的互作机制的研究奠定基础。

树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）是介导固有免疫和获得性免疫的桥梁，DCs能够促进NK活化，后者会进一步诱导DCs的成熟，启动相关的抗感染、抗肿瘤免疫应答。为阐明重组新城疫病毒HN基因乳酸菌（简称重组菌）对DCs介导NK活化作用机制，本项目拟通过流式细胞术（FCM）、荧光定量PCR及ELISA等对重组菌诱导DCs活化NK杀结肠癌作用、DCs活化NK的途径以及NK对DCs活化作用等方面开展了系列研究，以揭示重组菌诱导DCs活化NK杀伤肿瘤的分子机制，旨在为DCs-NK之间互作机制的研究奠定基础。. 为明确构建重组菌的稳定性和检测的便捷性，本项目构建了有绿色荧光示踪作用的重组菌。并检测到重组菌传30代以上仍可表现出荧光效应。免疫印迹检也检测到表达蛋白具有反应原性，且FCM检测表明HN蛋白表达于菌体表面。. 为明确重组菌对DCs及NK在动物体内活化的影响，本项目建立了皮下结肠癌移植瘤、原位移植瘤及肠外肺转移瘤模型，明确了重组菌免疫后能抑制肿瘤的生长及转移，增强肿瘤组织中炎性细胞浸润。且重组菌能促进荷瘤鼠DCs成熟及IFNγ分泌，并促进荷瘤鼠NK增殖、活化及向肿瘤的浸润。. 为阐明重组菌介导DCs对NK活化的影响。我们通过免疫磁珠（MACS）分选静息状态下NK和成熟DCs，二者共培养后，检测到了活化DCs能增强NK杀肿瘤效率、提高杀伤活性（分泌IFN-γ和颗粒霉素B）。为明确NK活化的机制，我们发现二类细胞作用后NK活化受体NKG2D基因及蛋白质表达均上调，且NK杀伤效率可被NKG2D中和抗体阻断。为明晰DCs活化NK的细胞因子分泌机制，利用Transwell培养体系检测到IL-12、IL-15的表达上调，且IL-12抗体能明显抑制NK的杀伤活性。阐明了重组菌活化后DCs可以通过细胞接触和细胞因子分泌而诱导NK活化，增强抗肿瘤效应。. 为明确重组菌对DCs-NK互作影响，我们检测到重组菌诱导活化NK对DCs成熟活化作用。结果活化NK可以促进DCs表面MHCII、B7等表达上调，促进IL-12、IL-15、IFNβ等Th1型细胞因子分泌增高。明确活化NK能增强DCs促进CD4+、CD8+ T细胞产生抗肿瘤免疫应答。综上，阐明重组菌能够提高NK-DCs相互作用，有利于机体的抗肿瘤免疫。