TRAIL和HN基因重组腺病毒的构建及其对禽白血病肿瘤细胞的抑制作用

本试验拟从鸡外周血液淋巴细胞和新城疫病毒（LaSota弱毒株）中分别扩增出TRAIL和HN基因序列，利用TRAIL对肿瘤细胞的靶向性、新城疫病毒HN基因的细胞凋亡作用和腺病毒高效稳定表达外源基因的特性，构建共表达上述基因的重组腺病毒，转染293细胞，包装获得高滴度的重组腺病毒后，通过检测重组腺病毒在不同用药剂量和给药途径下在禽白血病(AL)肿瘤动物模型血液中的滴度、不同组织中外源基因的蛋白表达水平、细胞活力和肿瘤细胞凋亡情况，评价重组腺病毒对AL肿瘤动物模型的抑瘤效果、稳定性和安全性。最终筛选出对动物模型的最佳用药剂量和给药途径。阐明重组腺病毒在AL肿瘤动物模型体内的表达规律及杀伤肿瘤细胞的生物学效应，探讨重组腺病毒对AL肿瘤细胞的抑制作用及其基因治疗的临床应用前景。

从鸡脾细胞和新城疫病毒LaSota株中分别扩增出TRAIL和HN基因序列，通过定点突变和重叠延伸拼接法实现TRAIL和HN基因以5个柔性氨基酸的linker连接；将获得的目的基因克隆到pShuttle-CMV穿梭载体中，经与pAd-Easy骨架载体共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd-TRAIL和pAd-TRAIL-linker-HN；转染AD293细胞，包装后获得重组腺病毒；应用RT-PCR对重组腺病毒在AD293细胞中表达情况进行鉴定；通过荧光显微技术和细胞毒试验检测病毒感染AD293细胞后的形态变化；利用氯化铯密度梯度离心法纯化病毒并测定其滴度；将获得的重组腺病毒体外转染禽淋巴白血病DT40细胞，通过RT-PCR和Western blotting检测重组腺病毒的感染性和外源基因的表达情况；分别采用MTT和流式细胞仪检测重组腺病毒对DT40细胞生长的影响以及TRAIL和TRAIL-linker-HN基因对动物模型的抑瘤作用，研究结果如下：.1）成功扩增出带有5个柔性氨基酸的TRAIL-linker-HN基因序列。.2）成功构建了重组腺病毒质粒pAd-TRAIL、pAd-TRAIL-linker-HN和对照空腺病毒质粒pAd-GFP。.3）包装后的Ad-TRAIL、Ad-TRAIL-linker-HN和Ad-GFP的病毒滴度分别为1.8×1010 PFU/ml、1.9×1010PFU/ml和1.5×1010PFU。.4）重组腺病毒体外转染DT40细胞，TRAIL和TRAIL-linker-HN基因均可抑制DT40细胞的生长并诱导肿瘤细胞凋亡(P<0.01)，且TRAIL-linker-HN基因的抑瘤作用（凋亡率为29.52%）显著优于TRAIL基因（凋亡率为4.86%）。.5）双基因治疗组的肿瘤动物模型中肿瘤生长缓慢，体积明显小于对照组，且与PBS和Ad GFP组相比，T/C分别为35.3％和27.1％；Ad-TRAIL-linker-HN组肿瘤质量（0.25 g±0.06g）明显小于PBS组（0.90 g±0.33g）和Ad-GFP组（1.1 g±0.35 g），且与PBS和Ad-GFP组相比抑瘤率分别为75.1％和78.7％。.本研究首次出构建融合表达的重组腺病毒，使双基因在抑制肿瘤细胞生长方面发挥协同作用。