山葡萄果皮转色机理及花色苷生物合成相关功能基因研究

Anthocyanins are a kind of important polyphenol secondary metabolites in Vitis amurensis, and which can absorb ultraviolet radiation, play an important role to the fruit color, flavor, taste and nutritional value. Anthocyanins have high medicinal value and show strong antioxidant, anticancer, immunomodulatory activity, protecting liver and lowering cholesterol at physiological environments. .V. amurensis is an important wild fruit resource, anthocyanin content is highly in skin. Thorough research the related enzymes which involved in anthocyanin biosynthesis have great significance to understanding the synthesis and distribution of anthocyanins and its further regulation in V. amurensis fruit. Aimed at the study of genetic resources specificity, we should make a thorough discussion for color-changing mechanism in skin; cloning expression to the related structural genes (F3H, F3 ' H and F3' 5 ' H et al.) and transcription regulator (MYB, MYC et al.) of V. amurensis skin anthocyanin biosynthesis; understanding the relationship between biosynthesis and gene expression; the function of genes, enzymatic reaction characteristics of various related enzymes; construction of plant expression vector, transgenic research, providing basis on the efficient utilization of genetic resources of V. amurensis.

花色苷是山葡萄所含有的一类重要多酚类物质，是次生代谢产物，可以吸收紫外线，对果实色泽、风味、口感和营养价值等都具有重要的作用。花色苷在生理环境下表现出强烈的抗氧化作用、防癌抗癌、具免疫调节活性、可保护肝脏和降胆固醇等，其药用价值极高。.山葡萄是我国野生果树的重要资源，果皮中花色苷含量高。深入研究参与花色苷生物合成的相关酶，对了解花色苷在山葡萄果实中的合成与分布，进一步对其进行调控具有重要意义。本研究针对山葡萄遗传资源的特异性，对山葡萄果皮转色机理进行深入探讨；对山葡萄果皮花色苷生物合成相关结构基因（F3H、F3′H和F3′5′H等）和转录调节因子（MYB和MYC等）进行克隆表达研究；了解花色苷生物合成与各基因表达的关系；研究相关基因的功能，各种相关酶的酶学反应特性；构建植物表达载体，进行转基因工作研究，为有效利用我国山葡萄基因资源建立基础。

花色苷是山葡萄果实中主要的多酚类次生代谢产物，影响植物源食品的感官和营养价值，还具有多种医药方面的生理活性。了解花色苷生物合成与各基因表达的关系，研究相关基因的功能，各种相关酶的酶学反应特性，构建植物表达载体，进行转基因工作研究，可为有效利用我国山葡萄基因资源建立了基础。. 实验采用RT-PCR、SMARTTM RACE技术从山葡萄成熟期果皮中克隆到了类黄酮途径中CHS、CHI、F3H、F3′H、F5′H、DFR、LDOS、UFGT、5GT、OMT、GST等关键基因，克隆后对其进行结构分析，比较其与其它种植物的异同，通过对蛋白质序列进行比对，分析山葡萄各基因的结构特点。研究结果表明，各基因与欧亚种葡萄相关基因的相似性均超过90%。在此基础上构建了这11个基因与其它物种相应基因的分子进化树，分析了与其它物种相关基因的亲缘关系。采用同样的方法获取了Vamyb2等转录因子的全长和部分片段，进行了结构和功能分析。. 构建了山葡萄果皮转色前、转色期（50%）和成熟期的cDNA文库，为相关基因的克隆、筛选，比较花色苷生物合成过程中基因的动态表达，积累基础材料。应用HPLC-MS/MS和实时荧光定量PCR技术对果实发育过程中花色苷类物质的含量变化及生物合成相关的结构基因mRNA转录水平进行了定量分析。研究结果表明，花青素类、二甲花翠素类和甲基花青素类花色苷对果皮中花色苷的组成起决定作用。为进一步掌握花色苷生物合成过程的基因表达情况，对三个时期的果皮进行了转录组测序。测序的完成，丰富了山葡萄转录组数据库信息。为后续功能基因研究，分子标记筛选以及基因改良育种提供了依据。根据基因克隆获得的序列设计反向引物，采用反向PCR方法获得关键基因的启动子序列及片段。F3H基因启动子序列中具有典型的CAATbox和TATAbox，具有多个光响应元件。该基因的转录和表达可能受到光照、干旱、激素等外界环境的胁迫，并推测它是与逆境胁迫有关的启动子。利用pQE30等质粒DNA建立山葡萄PQE30-Xa-VAm3GT、PQE30-Xa-VAm5GT、PQE30-Xa-F3H等结构基因在大肠杆菌中的表达系统，了解融合蛋白功能。