非光依赖型葡萄果皮花色苷合成的相关基因克隆和筛选

When sunlight was excluded from fruit set until maturity, the red grape 'Jingxiu' failed to color, while 'Jingyan' ('Jingxiu' × white grape 'Xiangfei') developed red color. The regulators of HY5-COP1 ubiquitination process will be cloned and identified in grape. Their expression at transcript/protein level among sunlight exclusion versus exposed 'Jingxiu' and 'Jingyan' at verasion and maturity will be compared. Meantime, transcriptomic and proteomic analyses will be performed to investigate the complex gene and protein variations among sunlight exclusion versus exposed 'Jingxiu' and 'Jingyan' at verasion and maturity. Interaction of the gene(s)/protein(s) that differentially expressed with VvCOP1 will be further tested so as to find the main gene(s)/protein(s) that may regulate the anthocyanin synthesis in sunlight-independent grape berry skin. The primary control mechanism of anthocyanin biosynthesis in the absence of sunlight would provide information for breeding sunlight-independent red grape cultivars, which would be valuable for cultivation in areas with low sunlight, for example glasshouses or other covered cropping.

项目采用对光敏感性不同的红色葡萄品种为试材：去光后果皮不着色的光依赖型'京秀'；去光后果皮仍可着色的非光依赖型'京艳'。根据拟南芥已有研究和葡萄基因组信息，克隆和鉴定HY5-COP1泛素化过程的调控因子，包括COP/DET/FUS家族、SPA家族、CIP家族等，分析 '京秀'和'京艳'中可能造成基因功能不同的DNA差异，以及在两个品种果皮（对照和去光处理；始熟期和成熟期）中转录和蛋白水平上的表达差异。同时，利用转录组和蛋白组技术，从整体上了解'京秀'和'京艳'果皮（对照和去光处理；始熟期和成熟期）之间的差异基因和蛋白，进行转录和蛋白水平上的表达验证。综合分析上述结果，继续验证差异基因和蛋白与VvCOP1的相互作用，从而确定果皮花色苷合成光依赖和非光依赖之间的关键差异基因和蛋白。这不仅有助于揭示光对花色苷合成的调节机理，而且对于培育易着色的红色葡萄品种，提高果实色泽品质具有重要的应用价值。

项目采用对光敏感性不同的红色葡萄品种为试材，分析果皮花色苷合成光依赖和非光依赖之间的关键差异基因和蛋白，得到了以下主要结果：1）利用表达谱（Solexa sequencing）分析技术，表明转录因子中有26个MYB，14个bHLH和23个WD40在两个品种中有差异表达。和泛素化过程相关的基因有189个，在‘京秀’中基本全部上调表达（188），而绝大多数在‘京艳’中没有变化（162）。2）通过转录组和蛋白组的结合分析，发现iTRAQ与RNA-Seq中差异蛋白和差异基因的重合性很低。可能泛素化过程的基因，比如COP1、HY5、COP9 signalosome、cullins、RING-Box1、COP1-interacting proteins等，以及光信号途径的基因参与了花色苷合成对去光的响应过程。3）VvCOP1和VvHY5的转录表达模式在光依赖型‘京秀’和非光依赖型‘京艳’果皮中一致，即在正常光照条件下从坐果期到成熟期，转录表达量不断上升，成熟期略有下降；去光处理后，VvCOP1转录表达量相对于正常光照下没有显著性差异，VvHY5转录表达量则显著性下降。可见，VvCOP1和VvHY5的转录表达可能不是造成非光依赖型葡萄去光后花色苷合成的原因。4）葡萄果皮总蛋白Western Blotting实验结果表明，正常照光和去光处理条件下，VvCOP1在‘京秀’和‘京艳’果皮中都有条带表达。VvCOP1蛋白在‘京秀’去光后没有明显变化，而在‘京艳’去光后表达量下降。免疫组化的亚细胞定位进一步表明，‘京秀’和‘京艳’在正常光照时，VvCOP1蛋白主要分布于细胞质中；去光后，‘京秀’VvCOP1蛋白聚集在细胞核，但‘京艳’中VvCOP1蛋白仍主要分布在细胞质中。说明VvCOP1的核质转运可能参与调控非光依赖型葡萄花色苷的合成。5）候选基因leucine rich repeat XI和PIF3在光依赖和非光依赖之间序列有差异。相较京秀及葡萄参考基因组，京艳leucine rich repeat XI少了两个TATA-box，多了一个GT1-motif光响应元件和一个CAAT-box。PIF3基因则有1个碱基的差异。项目不仅有助于揭示光对花色苷合成的调节机理，而且对于培育易着色的红色葡萄品种，提高果实色泽品质具有重要的应用价值。