基于一株特殊感染性的肠道病毒71型小鼠感染模型及其致病机理研究

Enterovirus 71 could cause major outbreaks of HFMD with neurological and systemic complications. No vaccines or effective drugs against EV71 exist, which was attributed to the absence of valuable animal models. We have isolated several EV71 strains from HFMD patients in our hospital and found one isolation with severely neurological virulence, which could induce neurological disease of 21-day mice. In this study, we try to use this isolation to establish possible animal models. After injecting different varieties of mice with different injecting routes and different titers of virus, the clinical manifestation, pathological changes and the immune responses of mice would be indicated. Based on the above analysis, the animal model would be established to apply to vaccine evaluation and drug screen. On the other side, we try to found out why our isolation could infect mice and lead to severe neurological disease. The recombinant virus with different gene-replacements and mutations would be constructed by using reverse genetic strategy. Next, mice are injected with different recombinant viruses and the humoral and cellular immune responses and the pathological changes would be analysed. Depend on these results, we could confirm the key point or fragment which could lead to death of mice. The study would give important implications on pathogenesis of EV71 and contribute to effective vaccines and drugs develpoment.

肠道病毒71型（EV71）是手足口病的主要病原体，有很强的神经毒和致死性，致病机理尚不完全清楚，亦无疫苗和有效的药物。阻碍EV71疫苗和药物研发的一个重要原因是缺乏合适的动物模型。此前报道的EV71感染模型多使用7日龄内乳鼠，且利用小鼠连续传代以提高毒株对乳鼠的敏感性，限制了其应用价值。我们从手足口病患者标本中分离的EV71毒株中筛选到1株具有强致病性毒株，克隆分纯后脑腔接种可诱发21日龄小鼠神经症状并死亡。本研究拟以该毒株构建毒种库，通过不同剂量、不同途径感染不同品系小鼠，研究EV71感染小鼠后侵染器官、病毒增殖及病理学指标，建立稳定、可控性强的适用于疫苗评价和药物筛选的标准化EV71感染动物模型；同时利用反向遗传学平台，通过片段置换、定点突变构建重组突变病毒，在动物水平上研究其感染特性，确定感染小鼠致死相关的毒力位点，为EV71疫苗和药物研发和评价及致病机理的研究提供动物实验。

基于从手足口病患者标本中分离的一株具有强致病性EV71毒株，克隆分纯后建立了可用于EV71小鼠感染模型的病毒种子库和工作库。基因分析表明，该毒株属EV71 c亚型，为Hn1株与Cq3株的重组病毒，其基因组1-3760nt与Cq3同源性高达99.86%（3756/3761），基因组3761-7407nt与Hn1株同源性更高达99.97%（3556/3557）。应用该毒株，制定了EV71小鼠感染模型的流程并应用于抗EV71药物的筛选和致病机制研究；同时利用反向遗传学平台，通过Overlap PCR、片段置换、病毒拯救等技术，采用该毒株基因组的P1区替换了BRCR株的P1区，构建了EV71 A/C亚型重组突变病毒EV71BRCRCP1毒株，重组病毒对不同细胞有不同嗜性，重组毒株感染乳鼠不引起死亡，在Vero细胞中重组病毒的增殖能力较母本毒株更强;，但在SK细胞中则弱于母本毒株，可用于EV71复合亚型疫苗的研发。.致病机制研究表明，EV71感染后宿主主动合成相关miRNA，可能是细胞的一种主动抑制病毒的复制、自我保护的反应；EV71的2C蛋白与宿主的蛋白磷酸酶PP1的激酶亚基的三个异构体PP1a，PP1b，PP1g均存在相互作用，PP1在EV71调控宿主天然免疫中发挥关键作用；证实了EV71感染过程中3D蛋白可被SUMO化，过量表达的3D蛋白可以被SUMO-1修饰，并且发现该修饰是一个可逆的过程，突变体L150A/D151A/L152A/K159R能很大程度的抑制sumo化；EV71病毒感染可以促进宿主蛋白Cyr61的表达，干扰去除Cyr61能降低EV71病毒的复制，过表达Cyr61则能增强EV71病毒的复制。组织病理学实验可见EV71感染死亡小鼠的脑、脊髓、肝脏等组织发生明显病理改变，死亡小鼠大脑实质细胞间见弥散性类圆样细胞浸润，神经元细胞及胶质细胞不同程度的变性、肥大。肝窦内见大量单个核为主的团状聚集，部分细胞核增大，呈多核改变。.发表论文3篇，其中SCI论文1篇，待发表SCI论文3篇；获计算机软件著作权3项；做为成果一部分获军队医疗成果一等奖1项（第1名）。培养博士研究生2名。