RANTES参与附睾管腔酸性微环境调控的作用和机制

精子在附睾中经历一系列成熟变化而获得运动和受精能力,其中附睾管腔液的酸性环境对保持精子能够处于静息状态并预防顶体酶的过早激活至关重要。新近研究发现，附睾上皮中的亮细胞泵出质子而维持管腔液酸性环境，这一过程受附睾尾部基细胞释放的NO刺激，但调控机制仍不清楚。我们的前期工作表明，RANTES主要表达于人附睾尾部的基细胞，而且可特异性促进基细胞释放NO，提示RANTES可能参与基细胞和亮细胞之间的串话调节。本项目拟用多光子激光扫描显微镜技术，从三维水平观察RNATES与其受体在基细胞的相互作用；在附睾上皮细胞原代培养和管腔微灌注两个层次上，探讨RANTES/NO通路对基细胞与亮细胞的串话调节；以及利用在体RNA干扰和局部给予抑制剂或阻滞性抗体的方法封闭RANTES，观察对附睾管腔酸性环境的影响。全面认识RANTES在附睾酸性微环境调节中的功能，对进一步阐明精子成熟的调控机制具有重要的意义。

附睾上皮细胞之间存在复杂的网络关系，共同维持管腔液的酸性环境，保持精子处于静息状态。其中基细胞可以感受附睾管腔内ANGII的浓度变化，并通过NO调节邻近亮细胞v-ATPase泵运H+，以达到维持附睾管腔液酸性微环境的目的。我们的前期研究表明，受激活调节正常T细胞表达和分泌因子RANTES主要表达于人附睾上皮的巨噬细胞, 且在附睾尾部表达较多。本研究首先用免疫组化及荧光双标技术观察RANTES及其受体在人和大鼠附睾的共定位；然后建立大鼠附睾微灌注模型，在附睾尾部给予1 μΜ RANTES刺激，对照组以pH 6.8的PBS代替，作用30分钟后取材，利用Real time-PCR、Weternblot、免疫荧光共聚焦技术检测V-ATPase以及iNOS在附睾上皮的表达变化；最后建立SD大鼠输精管切除模型以破坏附睾管腔酸性微环境，进一步利用Real time-PCR、Western-blot、免疫荧光检测V-ATPase的表达变化、放免法检测附睾组织匀浆液上清内ANGII浓度的变化，Real time-PCR、Western-blot检测ANGII受体AGTR2、RANTES、CCR1、CCR5以及iNOS表达的变化。结果：免疫组化结果显示RANTES、CCR1、CCR5在人和大鼠附睾头、体、尾均有表达，且在尾部表达较强，免疫荧光双标显示RANTES表达于人和大鼠附睾上皮的巨噬细胞，CCR1、CCR5和RANTES在人和大鼠附睾头、体、尾均有共定位信号。附睾尾部微灌注RANTES刺激后，与对照组相比，大鼠附睾组织iNOS、V-ATPase表达明显增高，免疫共聚焦结果进一步证实附睾巨噬iNOS表达增强，亮细胞顶膜V-ATPase聚集明显增多。输精管切除术后8周，手术组附睾管壁变薄，管腔增大、不规则，附睾液pH值升高；附睾尾部V-ATPase表达明显降低，附睾亮细胞顶膜V-ATPase聚集减少；附睾组织内ANGⅡ浓度显著下调，AGTR2、RANTES、CCR1、CCR5及iNOs的表达均降低。结论：RANTES与受体CCR1、CCR5在人和大鼠共表达于附睾上皮巨噬细胞，RANTES可能在ANGII的刺激下，通过与受体结合促进巨噬细胞释放NO，参与基细胞与亮细胞的串话机制，从而协助维持附睾管腔酸性环境的平衡。