RANTES与附睾精子的结合机制及对精子运动的影响

Sperm abnormalities is the significant reason for male infertility, the sperm which produced by testis would acquire motility and maturity through modification by epididymal protein. Recent studies have demonstrated RANTES in the seminal plasma of immune-infertile men was in significantly lower concentrations, but the detail mechanisms is unknown. RANTES can be gained through interacting with its chemokine receptor(s) or binding to certain glycosaminoglycan (GAGs) subpopulations. Our previous study has demonstrated that RANTES that originating from the epididymis can associate with sperm, but the association was not mediated by its receptors. So, it infered that RANTES may bind to the sperm through interaction with GAG. In this application, we study to apply the techniques of morphology and molecular biology to find the co-localization of RANTES and GAG, make sure that RANTES interaction with sperm mediated by GAG. To explore the binding mechanism of RANTES and GAG by destruction and closed the GAG site. Then research the effect of RANTES on sperm motility in vivo and by construction RNA interference model of RANTES in mouse epididymis. The application will be great significance to further clarify the regulatory mechanism and male infertility diagnosis and treatment.

精子发育异常是导致男性不育的重要原因，睾丸产生的精子经附睾分泌蛋白的修饰作用才能最终获得动力并成熟。近年来的研究表明RANTES在免疫性不育患者精液中的浓度偏低，但具体作用机制不明。RANTES一般通过与其受体或GAG结合两条途径发挥生物学效应。我们的前期工作证实，附睾分泌的RANTES能与精子结合，但不是通过受体途径，提示RANTES可能通过GAG与精子结合。本项目拟运用形态学和分子生物学手段，在小鼠附睾精子上找到与RANTES共定位的GAG，并证实RANTES与GAG在附睾精子上的结合关系；在此基础上破坏或封闭GAG位点进一步探讨RANTES通过GAG与精子的结合机制；再在整体动物水平上分析RANTES结合量与精子动力之间的关系，并通过构建小鼠附睾RANTES的RNA干扰模型，研究RANTES对精子运动的影响。该项目对进一步阐明精子成熟的调控机制和男性不育的诊断治疗有重要意义。

受激活调节正常T细胞表达和分泌因子（RANTES）是趋化性细胞因子CC亚家族成员，它最初被认为是一种免疫细胞的趋化因子，可诱导T细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、嗜酸性和嗜碱性粒细胞。最近的研究表明，RANTES也存在于成人精液中。发现RANTES在免疫性不育病人的精液中含量明显低于正常生育人群。有研究观察到高浓度的RANTES能干扰顶体反应和精卵融合过程。因此，一定浓度的RANTES可能在射精前男性生殖道精子抗原性免疫调节和女性生殖道性交后精子的受精能力中发挥作用。不同浓度的RANTES在体外表现出不同的效应。低浓度时RANTES以单体或二聚体的形式存在，直接与G蛋白偶联受体（GPCR）CCR1，CCR3和CCR5结合。除了经典的趋化因子激活反应外，RANTES还能形成多聚体通过与细胞表面糖胺聚糖（GAG）结合发挥效应。我们前期的研究表明人附睾是精液中RANTES的来源之一，RANTES在小鼠附睾的表达和定位与人类似，同时我们发现附睾来源的RANTES能结合于附睾精子的尾部中段。但RANTES与精子结合的具体机制尚不清楚。本项目运用逆转录PCR(RT-PCR)、免疫组化和免疫荧光染色发现由小鼠附睾上皮的顶细胞和狭窄细胞分泌的RANTES能与附睾精子结合。流式细胞检测法实验显示RANTES与附睾头体尾段精子的结合呈递减趋势。此外，发现CCR1、CCR3和CCR5在附睾精子上有表达，都定位于精子的头部，而RANTES定位于精子的尾部中段。同时我们通过向大鼠附睾尾部灌注碱性PBS，发现附睾RANTES 表达增强，V-ATPase在附睾顶细胞聚集增多；进一步微灌注RANTES后，附睾V-ATPase表达增强，在亮细胞顶部聚集增多。此外，提取附睾尾部精子，外源添加RANTES后，CASA检测发现精子活率无明显改变，提示RANTES可能不影响精子的运动。本项目的研究揭示附睾分泌的RANTES参与了附睾管腔酸环境的调节，它不通过受体与精子结合，结合于精子尾部中段的RANTES对精子的运动没有影响。本研究表明RANTES参与了精子的成熟调控，为男性生殖研究提供了新的靶点。