橡胶树产胶密切相关ABC转运蛋白基因的筛选与功能分析

橡胶生物合成是一种典型的植物类异戊二烯次生代谢，是影响橡胶产量的首要因素。ABC（ATP-Binding Cassette）转运蛋白是目前已知最大、功能最广泛的蛋白家族，在植物次生代谢产物的积累和跨膜转运中起着重要的作用。我们通过筛选乙烯刺激橡胶树胶乳消减文库及茉莉酸诱导橡胶树胶乳cDNA文库，克隆了4个ABC转运蛋白基因EST。初步研究表明其中两个在乙烯或茉莉酸刺激（刺激产胶）条件下上调表达，根据现有的文献推测其可能与产胶代谢过程中的物质跨膜运转及积累密切相关。本项目将利用我们建立的多个橡胶树胶乳表达基因序列数据库及橡胶粒子蛋白表达谱，结合本课题组建立的"橡胶生物合成体外实验系统"，全面筛选和鉴定与产胶性状密切相关的ABC转运蛋白基因，对候选关键基因产物进行亚细胞定位和功能分析，重点分析其与橡胶生物合成的关系。研究结果将为橡胶树新型高效采胶刺激剂的研制和育种新技术的发展提供理论依据。

橡胶生物合成是一种典型的植物类异戊二烯次生代谢，是影响橡胶产量的首要因素。ABC转运蛋白是目前已知最大、功能最广泛的蛋白家族，在植物次生代谢产物的积累和跨膜转运中起着重要的作用。前期相关实验结果显示ABC转运蛋白可能参与橡胶树产胶代谢。本项目从橡胶树胶乳及树皮中克隆了8个ABC转运蛋白亚家族79个ABC转运蛋白基因EST，并通过电子克隆及RACE技术获得了其中29个基因的全长cDNA序列。利用半定量RT-PCR技术及荧光定量PCR技术进行初步的表达分析，从50个胶乳表达ABC转运蛋白基因中筛选获得了7个可能与产量性状正相关ABC转运蛋白基因。利用荧光定量PCR技术进一步对这7个基因进行了组织表达差异分析、乙烯诱导表达差异分析、茉莉酸诱导表达差异分析及伤害诱导表达差异分析，筛选出HbABCB15进行了高产及低产橡胶树品系间表达差异分析、死皮及健康橡胶树胶乳表达差异分析。表达分析结果表明，HbABCB15基因与橡胶树产量性状正相关。而HbABCD1与拟南芥AtABCD1高度同源，表达分析表明其可能具有与AtABCD1类似功能，与橡胶树内源茉莉酸合成相关。原核表达了HbABCB15及HbABCD1基因片段并制备其抗体。利用Western blot技术对HbABCB15及HbABCD1在胶乳中的表达进行了分析。Western blot结果表明这两个蛋白不存在于胶乳中（胶乳为橡胶树乳管细胞的细胞质），结合基因表达分析结果表明HbABCB15可能定位于橡胶树乳管细胞膜。因此未能按照原计划通过胶体金免疫电镜分析并利用胶乳体外合成系统研究基因功能。目前已构建载体，HbABCD1基因拟通过转基因拟南芥COMATOSE缺陷株鉴定其功能。HbABCB15基因则拟通过转基因与橡胶树具有类似乳管系统的橡胶草以鉴定其功能。研究结果将为橡胶树新型高效采胶刺激剂的研制和育种新技术的发展提供理论依据。