橡胶树产胶相关大小橡胶粒子差异表达蛋白的筛选与功能分析

The rubber particle is a special organelle in the laticifers of Hevea brasiliensis(rubber tree). Rubber biosynthesis is carried out by many related rubber particle proteins together, and the proteome changes of rubber particles significantly affect the rubber biosynthesis. The rubber particles of rubber trees could be categorized into the small rubber particles (SRPs) and the large rubber particles (LRPs) according to their different development, and the ratio of rubber biosynthesis is greatly different between the SRPs and the LRPs, but the underlying molecular mechanisms remain unknown so far. Our previous studies have demonstrated that the SRPs and the LRPs had differential protein profiles on the SDS-PAGE gels, which implies that the differential protein profiles of the SRPs and the LRPs might be the main factor that causes the different rubber biosynthetic capability between the SRPs and the LRPs. In this project, the differentially expressed proteins between the SRPs and the LRPs will be first identified using two dimension difference gel electrophoresis (2D-DIGE), isobaric tags for relative and absolute quantification (iTRAQ) and mass spectrometry. In the light of the identified protein data, rubber particle proteins related to rubber production (biosynthesis) will be selected as candidate proteins for investigations. The key candidate proteins will be further selected for gene cloning and expression, subcellular localization, and functional analysis using RNA interference (RNAi). The research would not only facilitate to unveiling the relationship between the proteome change of the SRPs and the LRPs and the rubber biosynthesis of rubber trees, but also to elucidating the molecular mechanisms of rubber biosynthesis, which would provide the theoretical basis for the molecular breeding studies of rubber trees.

橡胶粒子是橡胶树乳管细胞中进行橡胶生物合成的一种细胞器。橡胶生物合成是在许多橡胶粒子蛋白的共同作用下完成的，橡胶粒子蛋白质组份的变化对橡胶生物合成具有重要的影响。橡胶树的橡胶粒子主要分为大橡胶粒子和小橡胶粒子，它们具有不同的橡胶生物合成能力，其分子机制迄今为止尚不清楚。我们前期研究证明，大小橡胶粒子在SDS-PAGE凝胶上具有不同的蛋白质表达谱，这表明大小橡胶粒子蛋白质表达上的差异可能是导致它们橡胶生物合成能力发生改变的重要原因。本项目将应用2D-DIGE和iTRAQ以及质谱技术，全面鉴定橡胶树大小橡胶粒子的差异表达蛋白，筛选与橡胶树产胶性状相关的橡胶粒子蛋白，并对候选关键橡胶粒子蛋白进行基因克隆与表达和亚细胞定位以及RNAi遗传转化等生物学功能分析。本项目研究将有助于揭示大小橡胶粒子蛋白质组份的变化与橡胶生物合成之间的关系，阐明橡胶生物合成的分子机理，为橡胶树分子选育种研究提供理论依据。

天然橡胶是关系国计民生的重要战略物资，主要来自于巴西橡胶树乳管细胞中的细胞质(又称为胶乳），其主要成分是具有橡胶生物合成功能的特殊细胞器—“橡胶粒子”。橡胶粒子具有从小到大的发育过程，并表现出不同的橡胶生物合成活性。我们以前的研究证明，大小橡胶粒子蛋白在SDS-PAGE上具有不同的表达谱，这表明大小橡胶粒子蛋白表达差异可能是导致它们的橡胶生物合成能力发生改变的重要原因。本项目在此基础上，采用2D-DIGE和质谱分析等技术，全面鉴定了橡胶树大小橡胶粒子差异表达蛋白，并对橡胶生物合成相关候选橡胶粒子蛋白进行了基因表达和生物学功能分析。取得的主要结果如下：.1、橡胶粒子蛋白质表达谱的构建.采用Shotgun并结合一维与二维电泳等蛋白质分离及质谱分析方法，获得了196种蛋白构成的橡胶粒子蛋白质表达谱，蛋白质分子量范围是3.9-194.2 kDa，等电点为4.0-11.2，这是迄今为止对产胶细胞器“橡胶粒子”最全面的蛋白质表达谱分析。.2、大小橡胶粒子差异表达蛋白的鉴定.应用2D-DIGE方法分离了大小橡胶粒子差异表达蛋白。在2D-DIGE胶图上共有53个蛋白点具有显著差异（差异倍数≥2.0，T值≤0.05），这53点对应于22个橡胶粒子蛋白，其中15个蛋白在小橡胶粒子上具有较高水平的表达。.3、产胶相关大小橡胶粒子差异表达蛋白的基因克隆与表达分析.对大小橡胶粒子差异表达蛋白HMGCS、phospholipase D、橡胶延长因子家族成员HbREF2.1与HbREF2.2和HbREF3等进行了基因克隆和表达分析，其中HbREF2.1、HbREF2.2和HbREF3是新鉴定的橡胶延长因子家族成员。.4、橡胶粒子蛋白HbREF3亚细胞定位及互作蛋白鉴定.水稻原生质体转化实验表明，HbREF3定位于细胞核内，这可能与HbREF3氨基酸序列内有一潜在的核定位信号有关。进一步以HbREF3同源的拟南芥和烟草相应基因转化烟草，它们也在细胞核表达。然而，Western blot实验证明HbREF3蛋白定位于橡胶粒子上。因此，HbREF3蛋白可能存在与其他蛋白互作的核质穿梭现象，通过酵母子双杂交鉴定的HbREF3互作蛋白中，除了与橡胶生物合成相关橡胶粒子蛋白外，还包括膜联蛋白和核蛋白等。