基于组学数据研究组蛋白甲基化修饰对肺腺癌耐药机制的影响

The long-term use of anti-tumor drugs will causes cancer cells to be resistant , which led to the therapeutic effect weakened or even failure and became an important problem in the treatment of cancer patients. Evidence that epigenetic modification is one of the important reasons for drug resistance of tumor cells. The current studies focus on DNA methylation and histone acetylation. Until Sharma et al (2010) discovered that histone lysine demethylase is a key factor leading to tumor resistance, which are powerful evidence to speculate that histone lysine methylation has an important relationship with tumor resistance. However, currently the studies of correlation between histone lysine methylation and resistance genes have not yet been thoroughly studied. The project is to base on the high-throughput sequencing data of lung adenocarcinoma cell lines, which were sensitive and tolerable to epidermal growth factor receptor - tyrosine kinase inhibitors respectively as the research object; find differential expression genes between the drug sensitivity and resistance lung adenocarcinoma cells through the transcriptomics method; then analysis the correlation between histone lysine methylation and these genes by chromatin immune-precipitation experiments, and dig out the resistance genes regulated by histone lysine methylation; final validate these important resistance genes. The completion of the project may provide clues for finding resistant lung adenocarcinoma principle, and explain the phenomenon of drug resistance and clinical treatment to provide help and ideas.

抗肿瘤药物的长期使用会使肿瘤细胞产生耐药性，进而导致治疗效果减弱甚至失败，这成为癌症患者治疗中一个重要的难题。证据表明表观遗传修饰是肿瘤细胞产生耐药的重要原因之一，目前的研究多集中在DNA甲基化和组蛋白乙酰化上。直到有研究发现组蛋白赖氨酸去甲基化酶是导致肿瘤耐药的一个关键因素，表明组蛋白赖氨酸甲基化与肿瘤耐药之间有着重要的关系。但是目前尚未对组蛋白赖氨酸甲基化与耐药基因间的相关性进行过深入的研究。本项目选择对表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂敏感的和耐受的肺腺癌细胞系作为研究对象，通过转录组学方法找到敏感性与耐药性肺腺癌细胞中差异表达的基因；通过免疫共沉淀实验，分析基因组上组蛋白赖氨酸甲基化与这些基因表达的相关性，挖掘出受组蛋白甲基化影响的耐药基因；通过实验手段验证挖掘出的相关重要耐药基因。本项目的完成可以为寻找肺腺癌耐药的原理提供线索，为解释肿瘤耐药现象和临床治疗提供思路。

本项目中，我们筛选到了敏感性与耐药性的肺癌细胞（PC9和PC9R细胞），通过分子生物学方法和一代测序方法，鉴定了PC9R细胞的T790M突变，并发现PC9R细胞中只有20%的细胞具有T790M突变。除此之外，PC9R细胞和PC9细胞在形态上也存在着很大区别。PC9R细胞较PC9细胞更像纺锤体，并非圆形状。从全基因组学方面，我们采用了高通量RNA-seq的方法，鉴定PC9和PC9R细胞间差异表达基因。我们完成了这两种细胞的转录组学(RNA-seq)实验和表观遗传组学（ChIP-seq）实验（技术路线中灰色部分），共获得RNA-seq数据4套（2个细胞，2组重复），ChIPseq数据4套（2个细胞，2种组蛋白赖氨酸甲基化形式）首先，每个细胞做了2个重复，采用生物信息学方法确定RNA-seq数据的可重复性和可靠性。我们计算了每个样本的RPKM（Reads Per Kilo bases per Million reads）值，并对比了两组数据的Pearson系数（0.89-0.95）。根据RPKM值，我们计算出差异表达基因的倍数，并筛选出2.44%即424个高表达基因(log2 (fold change) > 1)，和1.22%即207个低表达基因(log10(fold change) < -1)。我们分别对差异表达基因进行了GO和KEGG的通路分析。GO结果表明高表达基因富集在系统发展, 细胞表层的触突发生等，均和细胞粘连相关。KEGG通路显示上调基因富集在O-glycan合成，hedgehog信号通路，ECM受体等通路中。在分析差异基因表达显著性时，发现编码组蛋白赖氨酸甲基化修饰酶基因，均有不.同程度的变化，如组蛋白H3K4去甲基化酶KDM1A在PC9/R中的表达下调了2.5倍，组蛋白H3K27的甲基转移酶MLL和EZH2也有不同程度的下调。其他形式的组蛋白修饰酶有不同程度的上调。我们选取了KDM1A在蛋白水平上的检测，与基因表达结果一致。此外，我们检测到EMT marker如TWIST1，MMP7， CDH2，ZEB2和TWIST2的表达量在PC9R比PC9中均在2倍以上。其次，我们通过DNase I-seq的方法研究了PC9和PC9R细胞的全基因组上转录因子的分布情况。其中，我们通过DNase I在全基因组中的分布，预测出了