嗜热真菌耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆、高效分泌表达和作用机制

β-1,3-1,4-葡聚糖酶（简称葡聚糖酶）能特异性水解谷物中β-1,3-1,4-D-葡聚糖，在啤酒和饲料工业中有重要应用价值。目前，已有许多关于细菌葡聚糖酶的纯化、性质、作用机制、基因克隆和高效表达的报道，但真菌特别是嗜热真菌葡聚糖酶的报道很少，而嗜热真菌耐热葡聚糖酶具有很大的工业应用价值。课题组率先在国内研究嗜热真菌葡聚糖酶，已筛选到多株性能优良产葡聚糖酶的嗜热真菌。在前期研究嗜热拟青霉耐热葡聚糖酶的纯化、性质和基因克隆基础上，本项目拟继续从自行筛选的嗜热真菌中克隆耐热葡聚糖酶编码基因，构建高效分泌表达系统，研究纯酶的性质和啤酒应用评价。国际上首次得到真菌葡聚糖酶的晶体，根据嗜热拟青霉耐热葡聚糖酶的晶体结构，对酶基因进行定点突变和功能表达，研究真菌葡聚糖酶的作用机制。项目对于解决葡聚糖酶的高效表达和阐明真菌葡聚糖酶的作用机制具有重要理论意义，同时对于啤酒品质改善等应用也具有现实意义。

围绕嗜热真菌耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究，三年来完成了嗜热拟青霉、米黑根毛霉和樟绒枝霉三类嗜热真菌β-葡聚糖酶的相关工作，另外，解析了米黑根毛霉β-1,3-葡聚糖酶的晶体结构。主要结果如下：.嗜热拟青霉葡聚糖酶在毕赤酵母中实现了高效分泌表达，5 L发酵罐液体发酵产-1,3-1,4-葡聚糖酶达55 300 U/mL。通过易错PCR与DNA改组相结合方法获得4500个突变酶，从中得到三个阳性突变体，分别为：PtLic16AM1，最适pH由7.0变为5.5；PtLic16AM2，最适pH由7.0变为5.0；PtLic16AM3，最适pH由7.0变为5.5，并增加了催化水解β-1,3-葡聚糖的活性。.筛选得到高产耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶的米黑根毛霉CAU432。优化后液体发酵最高酶活力6230 U mL-1，5 L发酵罐酶活达7783 U mL-1，纯酶的比酶活力28818 U mg-1，，最适pH和温度分别为pH 5.5和60 °C。从中克隆得到-1,3-1,4-葡聚糖酶基因RmLic16A，该-1,3-1,4-葡聚糖酶属于糖苷水解酶16家族，最高同源性60%。成熟蛋白含294个氨基酸，分子量31,564 Da，pI为3.9。另外，克隆和表达了米黑根毛霉GH81家族β-1,3-葡聚糖酶（RmLam81A）。成功破解并首次报道了糖苷水解酶81家族的新型β-1,3-葡聚糖酶的晶体结构，该结构与其它报道的β-葡聚糖酶的结构完全不同。.樟绒枝霉S168粗酶液经纯化得到一种碱性β-1,3-1,4-葡聚糖酶McGlu1。该酶的分子量44.7 kDa，是一种单亚基蛋白，最适pH10.0，最适温度55℃。EDTA和β-巯基乙醇不会抑制该酶酶活力，说明该酶反应不需要金属离子和二硫键的参与。.经过三年的研究，达到的预期目标，并在β-葡聚糖酶的结构方面取得突破。新筛选得到两类产耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶的嗜热真菌，克隆和表达了两个β-葡聚糖酶基因，探明了嗜热真菌耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶的作用机制。相关成果发表论文6篇，其中SCI收录4篇，分别发表在J. Agric. Food Chem.、J. Biotechnol.和Acta Cryst. D等，最高影响因子14.1。同时，获授权国家发明专利2项，申请2项。在该项目资助下毕业研究生6名，其中博士3名。