耐热、高活性β-1，3-1，4-葡聚糖酶的构建

β-葡聚糖酶是消除谷物饲料中抗营养因子β-葡聚糖的主要酶制剂，它为大麦、糠麸等在饲料中的大量应用，解决我国玉米紧缺和玉米南少北多的问题具有重要价值。目前β-葡聚糖酶在饲料中应用的主要问题是酶的耐热性差，难以经受饲料制粒时的高温，严重影响该酶的使用效果；有些微生物的β-葡聚糖酶虽然较耐热，但是耐热酶的最适温度往往较高，不利于酶在动物胃肠道条件下充分发挥作用。所以，研制既耐热又在生理温度下酶活高的β-葡聚糖酶是急待解决的重大难题。本课题在前期研究的基础上，采用杂合、融合和双催化结构方法，利用SOE基因拼接技术构建在动物生理条件下活性高的耐热酶，促进大麦等谷物在饲料中大量使用。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶 (E.C.3.2.1.73，简称β-葡聚糖酶)是一种重要的工业酶制剂。由于在啤酒糖化和饲料制粒过程中需要较高的温度（70℃～80℃），造成添加的β-葡聚糖酶活性降低，从而严重影响酶的实际应用效果。β-葡聚糖酶的耐热性差成为应用的主要瓶颈。课题以热稳定性较好的热纤梭菌 (Clostridium thermocellum)和酸性条件下酶活性较高的解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)β-葡聚糖酶为材料，采用基因重叠延伸技术 (SOE)，将解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶的催化结构域与热纤梭菌β-葡聚糖酶的催化结构域连接，建双催化结构域β-葡聚糖酶（命名为RQ）；RQ的比活力为2434 U mg-1，RQ的最适反应温度为70 ℃，最适反应pH值为6.0；耐热性研究表明：RQ在80 ℃温度下处理30 min，有67%的残余酶活，RQ的耐热性与热纤梭菌β-葡聚糖的耐热性相接近；RQ的Km和Kcat/Km分别为1.2 mg mL-1和1014 mL mg-1 s-1，是解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶和热纤梭菌β-葡聚糖酶催化效率之和的2.41倍。表明双催化结构域β-葡聚糖酶不是简单的解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶和热纤梭菌β-葡聚糖酶的酶学性质的叠加，而是赋予了新的酶学特性的β-葡聚糖酶。. 构建了两个融合酶（热梭菌β-葡聚糖酶N-端13和27个氨基酸残基分别与解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶的N-端融合，分别命名为R13和R27），R13和R27的比活力分别为1074 U mg-1和1013 U mg-1，在80 ℃温度下处理30 min，R13和R27分别保留34%和52%的残余酶活，分别高出解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶残余酶活的18%和36%， R27较R13的耐热性提高18%，表明热纤梭菌β-葡聚糖酶的耐热性不仅在其催化结构域N-端起作用，它的整个催化结构域都发挥作用。将RQ酶中β-葡聚糖酶活性位点突变体(命名为RQM酶)进一步证明了这一结论。.将RQ酶的基因工程菌发酵培养基和发酵条件优化，优化后的发酵培养基发酵产β-葡聚糖酶的量为110 U mL-1，比初始发酵培养基提高11%。