组蛋白表观修饰对乙型肝炎病毒cccDNA微小染色体稳定性的调控及其机制研究

The Hepatitis B virus (HBV) covalently closed circular DNA (cccDNA), which organizes into a minichromosome structure in the nucleus of HBV-infected cells, serves as the template for the viral transcription and replication and plays a key role in viral persistence. Current therapies, including the interferon-alpha-based therapies, do not efficiently target cccDNA and thus are limited in their effectiveness, and the mechanisms involved in the destabilization and elimination of cccDNA and related host factors remain obscured. Histone epigenetic modifications, which play an important role in regulating gene expression and maintaining the genome stability, have been shown to regulate the transcription of cccDNA minichromosome, and we recently found that they may also affect the stability of cccDNA. Here, the pattern of histone epigenetic modifications that contributes to the destabilization or the non-cytolytic degradation of cccDNA and the factors and mechanisms involved will be examined in HBV-infected cell models and liver samples. We will further explore a new strategy for eliminating cccDNA, that is to promote the interferon-induced degradation of cccDNA through pretreatment of the HBV-infected cells to alter the status of acetylation and methylation of the specific sites in cccDNA-bound histones, which we speculate would destabilize the cccDNA minichromosome. These studies will deepen the understanding of the mechanism of persistence and elimination of cccDNA, thus may provide new insights into therapeutic approaches for eliminating cccDNA and even cure chronic HBV infection.

乙型肝炎病毒（HBV）转录复制的模板——共价闭合环状DNA（cccDNA）在细胞核内以微小染色体形式存在，被认为是HBV持续感染的核心，然而，当前治疗手段（含干扰素）无法有效靶向cccDNA，对其如何维持稳定及如何被清除的机制认识亦不清。组蛋白表观修饰作为一种调节基因表达及维持基因组稳定的重要机制，国外及申请人已发现其参与调控cccDNA转录活性，但尚不明确其对cccDNA稳定性的影响。基于此，本项目将在HBV细胞感染模型及组织标本中研究可调控cccDNA稳定性及促进cccDNA非杀细胞式降解的组蛋白表观修饰形式，鉴定相关参与因子及调控机制；并探索通过干预cccDNA组蛋白乙酰化或甲基化修饰以降低其稳定性，进而（联合干扰素等）降解清除cccDNA的新型抗病毒策略。这有助于深化对cccDNA稳定存在及降解清除相关机制的理解，并为最终靶向根除cccDNA乃至治愈乙肝提供理论基础与分子靶点。

乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的慢性乙型肝炎及相关肝病长期危害国民健康。HBV感染肝细胞后，病毒基因组在细胞核形成共价闭合环状DNA（cccDNA）并以微染色体（minichromosome）形式长期存留于细胞核内，由于其不能被现有药物有效清除，被认为是乙肝病毒感染慢性化和难以治愈的重要分子基础。本团队和国内外先前研究发现表观遗传机制在调控cccDNA转录活性中起重要作用，但尚不清楚其对cccDNA稳定性的影响。鉴于此，综合利用HBV感染模型和近年来研发的cccDNA体内外模型，以干扰素（IFN-α）处理和HBx敲除来建立cccDNA转录活性抑制的表征，应用染色质免疫共沉淀、微球菌核酸酶（MNase）敏感性实验和ATAC-seq等技术评价cccDNA的表观修饰特征、可及性和与抗病毒因子的结合情况，以比较不同转录活性和表观状态下的cccDNA在稳定性和抗清除方面的差异。研究发现，与不处理或野生型病毒相比，IFN-α处理或HBx敲除后HBV cccDNA的转录活性低下，其组蛋白表观修饰呈抑制性状态，开放性和可及性广泛降低。而此种可及性的降低，导致cccDNA与RNA Pol II的结合减少，同时阻碍cccDNA与抗病毒因子APOBEC3A和靶向性CRISPR/Cas9分子的结合，从而显著削弱相关脱氨基和切割编辑效应。进一步采用重组HBV cccDNA小鼠模型，发现相较正常转录活性的cccDNA，转录抑制的cccDNA在体内的清除速率显著更慢。基于此，提出通过提高cccDNA的可及性以促进其清除的策略，并在细胞模型中进行验证。结果证实，将组蛋白去乙酰化酶抑制剂Belinostat处理含cccDNA的细胞，能上调cccDNA上H3和H4组蛋白的总乙酰化水平并增加cccDNA的可及性，由此提升AOPBEC3A对cccDNA的脱氨基效率。该研究首次揭示了转录活性和表观调控对HBV cccDNA微染色体稳定性的影响，加深了对cccDNA异质性存留方式和清除机制的认知，为研发靶向清除HBV基因储存库的策略提供了新视角和理论技术支撑。相关工作在国际肝炎肝病领域权威期刊Hepatology等发表SCI论文3篇，项目累计培养3名博士研究生，项目负责人2020年获国自然优青项目。项目总体已完全达到项目预期目标。