微小RNA-548ah调控组蛋白去乙酰化酶4在乙型肝炎病毒复制和表达中的作用及机制研究

MiR-548ah is a high expression of miRNA in monocytes of patients with chronic hepatitis B screened using microRNA chip by us. Previous researches found that miR-548ah also expressed in HepG2,2,15 cell and promoted the replication and expression of hepatitis B virus(HBV). Software prediction showed that HDAC4 closely related to acetylation is one of the target genes of miRNA-548ah. The inhibition of miRNA-548ah affect the levels of HDAC4 expression. In this research, the direct effect of miRNA-548ah on HDAC4 is demonstrated with dual luciferase experiments. The overexpression and knockdown technology were used to evaluate the effect of miRNA-548ah on the replication and expression of HBV. Chromosome immunofluorescence technique is used to investigate the effect of miRNA-548ah on the acetylation histone combined with cccDNA. This research will not only provide new understanding for the pathogenesis of chronic hepatitis B and potential molecular targets to explore the prevention and treatment of chronic hepatitis B.

miR-548ah是我们用芯片筛选的、在慢性乙型肝炎患者单核细胞中高表达的一条微小RNA。前期研究发现，miR-548ah可在HepG2细胞株中表达并促进肝癌细胞株中HBV的复制和表达。软件预测组蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）是miR-548ah潜在的靶基因，人肝癌细胞株中miR-548ah与组蛋白去乙酰化酶4的表达呈负相关。本研究拟采用双荧光素酶基因报告实验验证miRNA-548ah对HDAC4的直接作用，肝癌细胞株和临床肝组织病理标本进行鉴定；应用过表达和敲低技术，分别在肝癌细胞株和HBV感染人源化肝脏小鼠模型上，探讨miR-548ah及HDAC4对HBV复制和表达的影响。染色体免疫荧光技术检测miRNA-548ah对cccDNA结合组蛋白乙酰化调控的影响。通过该研究，不仅将为阐明调控乙型肝炎病毒的机制提供新的认识，而且为探索防治乙型肝炎病毒感染提供潜在的分子靶标。

慢性乙型肝炎是目前严重危害人类健康的病毒性疾病之一。微小RNA是近年来发现的在转录后发挥调控作用的一类小RNA分子，研究表明，多种微小RNA在慢性乙型肝炎的发病机制中发挥重要作用。miRNA-548ah是课题组应用基因芯片筛选的在CHB患者外周血单个核细胞中高表达的一种miRNA，其在乙型肝炎病毒复制和表达机制中的作用尚不清楚。本项目从临床、细胞和小鼠模型三个方面，应用miRNA分子的过表达和敲低、双荧光素酶报告载体实验及染色体免疫共沉淀等技术，系统研究了miRNA-548ah在HBV复制和表达中的作用及其分子机制。结果表明，与对照组比较，miRNA-548ah模拟剂组HepG2,2,15细胞，转染pHBV1.3质粒的HepG2细胞和Huh7细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg及HBV DNA表达水平均明显升高，细胞中HBV前基因组RNA也明显升高，而转染miRNA-548ah抑制剂组则均明显减低。miRNA-548ah过表达载体感染HBV小鼠模型，外周血清中HBVDNA的表达水平明显升高。生物信息学方法预测HDAC4为miRNA-548ah的候选靶基因。miRNA-548ah模拟剂显著抑制psiCHECK-HDAC4载体荧光素酶表达活性，HDAC4mRNA和蛋白质表达明显减低。HDAC4过表达后，HepG2,2,15细胞中HBV前基因组RNA明显下降，干扰HDAC4表达后则明显升高。染色质免疫沉淀实验结果发现，与阴性对照组比较，miRNA548ah激动剂组HepG2,2,15细胞中cccDNA的表达水平明显升高，miRNA548ah抑制剂组cccDNA的表达水平明显降低。HDAC4过表达后AcH3组cccDNA的表达水平明显升高，而H3组未见明显差异。慢性乙型肝炎患者肝组织中miRNA-548ah与HDAC4的表达呈显著负相关。miRNA-548ah可通过调控靶基因HDAC4，抑制与cccDNA结合组蛋白的去乙酰化，促进cccDNA的复制，增强了HBV的复制和表达。本研究不仅为慢性乙型肝炎的分子发病机制提供了新的阐释，同时为防治慢性乙型肝炎提供了新的潜在分子靶标。