SET结构域蛋白6（SETD6）对乙型肝炎病毒cccDNA转录活性的调控作用及其机制研究

Hepatitia B virus covalently closed circular DNA (HBV cccDNA) transcriptional activity control is the key factor in functional cure for chronic hepatitis B. Identification of host epigenetic molecules involved in the regulation of HBV cccDNA transcriptional activity is critical. We previouly analyzed the gene expression profile of liver tissues in chronic hepatitis B patients and found that the expression level of SET domain-containing protein 6 (SETD6) was significantly higher in the liver tissues of inactive carrier patients with low HBV replication than immune toletant patients with high viral replication. Furthermore，knockdown of SETD6 resulted in the significantly increased HBV replication. Previous studies have reported that SETD6 has methyltransferase activity and regulates gene expression through methylation of histone lysine. Based on this, we hypothesize that SETD6 may methylate the lysine on histone that binding to cccDNA, altering the cccDNA conformation, affecting the binding of the transcription factor Sp1, and further regulate cccDNA transcriptional activity and viral replication. We intend to use HBV infected cell model and mouse model to study the molecular mechanism of SETD6 regulating cccDNA transcription activity, which may provide a new theoretical basis for the functional cure of chronic hepatitis B.

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（HBV cccDNA）转录活性的控制是慢性乙型肝炎实现功能性治愈的关键因素。鉴定出参与调控cccDNA转录活性的宿主表观遗传学分子具有重大意义。前期我们分析了慢乙肝患者肝组织的基因表达谱，发现SET结构域蛋白6（SETD6）在病毒低复制的非活动性HBsAg携带期患者中的表达量显著高于病毒高复制的免疫耐受期患者。SETD6基因敲减后HBV复制水平显著增强。既往研究报道，SETD6具有甲基转移酶活性，通过甲基化修饰组蛋白调控基因表达。我们推测：SETD6通过催化与cccDNA结合的组蛋白赖氨酸发生甲基化，调节cccDNA构象，影响转录因子Sp1的结合，进而调控cccDNA转录活性并进一步抑制病毒复制。我们拟用HBV感染细胞模型和模拟HBV cccDNA慢性化的小鼠模型，研究SETD6调控cccDNA转录活性的分子机制，为实现慢乙肝的功能性治愈提供新的理论基础。

HBV cccDNA的持续存在和活跃转录是慢性乙型肝炎难以治愈以及抗病毒治疗停药后复发的根本原因。目前针对HBV感染的抗病毒治疗方案均不能清除作为转录和复制的模板cccDNA。另一方面，对cccDNA转录活性的持续控制也能够清除病毒复制，大大减低病毒抗原生成，使HBV处于静止的不活跃状态，达到慢乙肝的功能性治愈。表观遗传学修饰是参与cccDNA转录活性调控的重要因素，包括DNA甲基化、组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化等。HBV感染能够诱导宿主DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）表达上调，催化cccDNA发生甲基化，进而抑制前基因组RNA（pregenomic RNA，pgRNA）的转录和病毒蛋白的产生。组蛋白甲基化是近期研究揭示的对cccDNA转录起到关键调控作用的因素。本课题组采用Affymetrix RNA芯片技术，分析了83例不同时期慢性乙型肝炎患者（其中非活动性HBsAg携带者 n=11，免疫耐受期患者 n=22）肝组织内的基因表达谱 [J Infect Dis. 2018 Jan 2. doi: 10.1093]，发现SETD6基因在非活动性HBsAg携带期和免疫耐受期的患者中的表达水平存在显著差异。数据显示在病毒低复制的IC期患者中组蛋白甲基转移酶SETD6的表达量明显高于病毒高复制的IT期患者，提示SETD6基因具有抗病毒活性。我们在稳定表达HBV的肝癌细胞HepG2.2.15细胞系中，采用特异性的小干扰RNA（siRNA）敲减SETD6基因，发现该基因敲减后HBV复制水平显著增强。因此，在细胞水平上验证了SETD6的敲减对HBV cccDNA转录活性以及病毒复制的增强作用，验证了SETD6通过其甲基转移酶活性增强 HBV cccDNA 上结合的组蛋白的甲基化水平，影响转录因子Sp1 的结合，进而抑制HBV cccDNA 的转录活性以及病毒复制的作用；建立高压尾静脉注射HBV 质粒构建模拟 HBV 慢性感染小鼠模型，验证SETD6 基因过表达在小鼠体内的抗病毒活性。