DNA羟甲基化酶Tet1介导的体细胞重编程的表观遗传机制研究

During development from a zygote to an adult, unique epigenetic pattern is developed in different cell lines to regulate the characterized expression profiles and differentiation potential. Therefore, epigenetic states including modifications on DNA and histones must be tightly regulated for proper transitions in both programming and reprogramming process. We found for the first time that, Tet1 (T) can replace Oct4 and initiate somatic cell reprogramming in conjunction with Sox2, Klf4 and c-Myc. We established the TSKM secondary reprogramming system and found the efficient reactivation of Oct4 is relying on Tet1 and 5hmC during TSKM reprogramming. Since the process in TSKM secondary reprogramming can be finished within 7 days, we could further detect more molecule events within the first fell cell divisions. The TSKM 2° reprogramming system that we have established will be a valuable tool for further investigation of the mechanisms of epigenetic remodeling involved in somatic cell reprogramming and for developing a systematic understanding of the events that occur in this exciting process. Importantly investigation on 5hmC and the risk of tumorigenesis, could be a key issue for future clinical applications of iPSCs.

体细胞重编程的核心是细胞表观遗传修饰的重编程，我们近期发表于Cell Stem Cell的封面文章首次证明了DNA羟甲基化酶Tet1可以催化核心多能基因Oct4转录调控区域的去甲基化与转录激活，并可以替代Oct4实现TSKM诱导的体细胞重编程；我们同时发现TSKM诱导极大降低了所形成iPS细胞的致瘤风险，并且发现二次诱导可高效快速实现重编程。为了深入理解TSKM诱导体细胞重编程的分子机制，我们在本课题中将利用这一独特的重编程系统深入分析诱导早期几个细胞周期内的重要分子事件；解析Tet1在体细胞重编程早期的表观遗传重塑过程中的作用机制；探讨基因组上不同表观遗传修饰之间的联系，以及它们对基因转录的调控机制。这一研究将有助于加深对体细胞重编程机制的理解，并将在推动重编程方法改善和临床应用等方面具有重要意义。

在本项目的支持下我们利用已有的诱导重编程平台，对Tet1对重编程的影响和其取代Oct4后主导表观重编程的机制进行了探讨。我们搭建了转录与DNA及组蛋白修饰的联动分析平台，对表观修饰与转录水平转变的检测平台。未解决研究中遇到的细胞材料稀缺的问题，我们在本项目的支持下开展了还研发和建立了微量细胞起始的转录组和表观组的测序平台。.首先，我们在研究中发现Tet1的作用不仅仅局限于Oct4的启动子区域，我们随后证明了Tet1可以取代其他的诱导重编程因子，实现重编程。其中Tet1与Oct4诱导获得的iPS细胞可高效地产生all-iPSC小鼠，并且小鼠的肿瘤发生率非常低。这一发现为探寻获得高质量iPS细胞的诱导方案，提高iPS细胞临床应用的安全性方面提供了新思路。其次，我们检测了TSKM诱导初期的转录和表观修饰变化，发现相对于OSKM诱导体系，TSKM诱导在早期存在更为广泛的组蛋白变化，但是Tet1的主动结合和促使的转变发挥作用，更主要的存在于诱导的更晚时期。然而在诱导的中后期，细胞诱导体系异质化更加明显，可以用于研究的细胞材料将进一步减少，这促使我们研发建立了一系列单细胞和低起始量表观检测的技术。最后利用单细胞的RNA seq和甲基化检测技术，成功明确了体细胞核移植中体细胞核内K9me3修饰去除失败对于2细胞发育的阻碍作用，以及K4me3修饰去除失败对于4细胞发育的阻碍作用，并研发了对卵母细胞联合注射Kdm4b和Kdm5b的mRNA，改善克隆胚胎发育的新方法。而利用微量细胞起始的ChIP seq技术成功的实现了对小鼠胚胎样品的组蛋白修饰测定，进而绘制了生命起始最初阶段的表观修饰图谱。并提出了H3K4me3调控基因表达和细胞特性建立的新机制。以上研究成果发表在Nature，Stem Cells，Cell discovery 等学术期刊，获得了广泛的关注。