卵细胞提取物诱导人成体细胞重编程及表观遗传机制研究

干细胞是修复各种损伤和退变的理想材料，现有来源难以满足临床需要。本项目组前期已创建诱导鼠成纤维细胞重编程技术并分析其部分表观遗传学机制。本研究拟利用前期创建的方法诱导人皮肤成纤维细胞重编程，通过观察细胞的形态变化和生长特性分析其诱导培养特性；利用实时定量PCR方法和流式细胞技术检测重编程细胞的多能干细胞相关基因的表达量。通过分析诱导前后重编程细胞的多能干细胞的标志基因的DNA甲基化、乙酰化和microRNA的变化来反应表观遗传学调控机制，通过体外定向诱导分化和体内畸胎瘤的形成检测体内外多向分化潜能。从而证实人皮肤成纤维细胞在鱼卵母细胞提取物的诱导下可以重编程为多能干细胞，建立完善的鱼卵母细胞提取物诱导人皮肤成纤维细胞重编程为多能干细胞的方法，解决多能干细胞获得难的问题；最终弄清鱼卵母细胞提取物诱导人皮肤成纤维细胞重编程的表观遗传学调控机制。

多能干细胞是一类具有向多种类型细胞分化潜能的细胞，在临床上，可用于机体组织损伤和遗传性疾病的治疗以及衰老器官的修复等。但是，由于干细胞的来源较为困难从而限制了其临床应用。鉴于此，本研究利用鱼卵母细胞提取物为重编程诱导剂，对人成纤维细胞进行重编程研究，并对重编程细胞的表观遗传机制进行研究，进一步通过动物疾病模型等试验观察重编程细胞对机体组织损伤的修复作用。结果显示：1. 利用鱼卵母细胞提取物重编程的人成纤维细胞表达干细胞标志基因Oct3/4、Sox-2、Nanog和c-Myc；2. 将重编程细胞注射于裸鼠皮下组织能够形成包含血管、神经、肌肉和脂肪等组织的畸胎瘤；3. 在特定诱导培养基诱导条件下，重编程细胞能够分化为（类）成骨细胞、（类）脂肪细胞和（类）神经细胞；4. 干细胞标志基因Oct4和Nanog基因启动子区域DNA甲基化结果显示，重编程细胞中这两个基因启动子关键区域的甲基化程度显著低于未编程的成纤维细胞，与干细胞特性维持相关通路MAPK和Wnt等中的关键蛋白p38、AS160和β-catenin的磷酸化水平显著上调；5. 将重编程细胞联合两种生物支架材料HAP/β-TCP/CS和KGM/HA分别移植给骨组织损伤动物狗和兔的损伤部位，组织切片和X光透射图片显示，重编程细胞联合支架材料能够不同程度修复骨损伤；6. 将人重编程细胞移植到胎猴肝脏中，在肝脏微环境作用下，重编程细胞能够分化成表达人肝细胞表面抗原的细胞；7. 将雄性小鼠重编程细胞移植到造血功能障碍的雌性小鼠体内能够显著延长小鼠生存时间，并在雌性小鼠体内能够检测到雄性个体细胞核型的细胞。这些研究结果表明：（1）利用鱼卵母细胞提取物重编程人成纤维细胞为具有多向分化潜能特性的干细胞是可行的；（2）与未编程细胞相比，重编程细胞改变了未编程细胞基因组的表观遗传学方式，至少在关键基因的甲基化和关键蛋白的磷酸化水平；（3）重编程细胞能够对多组织损伤进行有效治疗和修复。