家蚕核型多角体病毒lef-11基因对病毒增殖的调控研究

Silkworm is an important economic insect, but also the mode insect of Lepidoptera. Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus（BmNPV） is pathogen of the Bombyx mori nuclear polyhedrosis disease. Because the molecular mechanisms of BmNPV infection and proliferation are not fully resolved, the anti-viral mechanisms resolving and antiviral breeding process of silkworm were hampered. In the early studies this project, more than 100 genes of BmNPV were silent one by one by RNAi tech, the gene silencing effects on proliferation and replication of BmNPV were compared under these same conditions, the lef -11,proliferation and replication key gene of BmNPV,were selected. We will use molecular biology and bioinformatics methods, idenfify nuclear localization signal and reveal the nuclear transport mechanism of LEF-11;analyze viral DNA replication and viral gene expression regulation, reveal the regulating molecular mechanisms of the virus proliferation;screen and identify the interaction proteins between the LEF-11and host cells,detect the transcriptome and proteome changes in BmN-SWU1 cells with lef-11 gene overexpression;establish the LEF-11 protein regulatory networks and elucidate the molecular mechanism of LEF-11 regulation of host cells. The project may lay the foundation for revealing the anti-viral mechanisms and antiviral breeding process of silkworm, improving the efficiency of baculovirus expression system and developing effective biocontrol agents.

家蚕是重要经济昆虫, 同时也是鳞翅目模式昆虫。家蚕核型多角体病毒是家蚕重要病害家蚕核型多角体病的病原，由于其侵染增殖的分子机制未完全解析，阻碍了家蚕抗BmNPV病毒的抗性机制解析和家蚕抗病毒育种进程。本项目在前期研究中通过对BmNPV编码基因进行逐一沉默，筛选到了病毒复制增殖的关键基因lef-11。本项目拟采用分子生物学和生物信息学等方法，鉴定LEF-11核定位信号，揭示其核转运机理；构建lef-11基因敲除病毒，解析其对病毒增殖的分子调控机制；通过免疫共沉淀技术筛选并鉴定与LEF-11互作的宿主蛋白，分析过表达lef-11的家蚕细胞中的差异表达基因，阐明LEF-11调控宿主细胞的分子机理。通过本项目研究，可完善BmNPV侵染增殖的分子机制和揭示BmNPV与家蚕的互作机制；可为解析家蚕抗BmNPV病毒的抗性机制、加快家蚕抗病毒育种进程以及开发高效的生防制剂奠定基础。

家蚕（Bombyx mori，B. mori）是一种具有很高经济价值和文化价值的泌丝昆虫，以家蚕为基础的蚕桑产业曾是我国经济发展中的功勋产业。家蚕核型多角体病毒（B. mori nucleopolyhedrovirus， BmNPV）病是养蚕生产上最常见的危害最严重的一类蚕病之一，每年给我国蚕桑业产业造成巨大的经济损失。但是目前其侵染机制及其调控宿主细胞作用机制仍然不是很清楚。为了解析BmNPV和宿主相互作用机制，为家蚕抗病育种提供靶标基因，本研究以家蚕核型多角体病毒lef-11基因为研究对象，采用分子生物学和生物信息学等手段，鉴定到LEF-11是一个13.1 KDa的小分子蛋白，确定LEF-11核定位信号位于aa72-101，揭示其能够和核转运蛋白相互作用进入细胞核，参与病毒DNA复制。亚细胞定位发现LEF-11在细胞中能够聚集到一处，非还原性SDS-PAGE结果表明LEF-11主要以四聚体的形式存在，LEF-11 C端多聚化功能域位于aa42-61，N端多聚化功能域位于aa72-101。通过Bac-to-Bac系统回复缺失多聚化功能域的LEF-11，鉴定了该多聚化功能域对病毒DNA复制是必要的；同时，对LEF-11多聚化功能域疏水性氨基酸定点突变，确定I55、Y58&I59、I85、L88&L89对LEF-11蛋白四聚体形成和病毒DNA复制是必要的。利用酵母双杂交技术和免疫共沉淀技术，确定有6个蛋白与LEF-11具有相互作用，分别是BmATAD3A、BmHSPD1、BmIMPI、BmSamui、BmMyosin及BmROBL2；过表达和敲出LEF-11互作蛋白后流式分析和Western Blotting显示BmATAD3A、BmHSPD1、BmIMPI和 BmMyosin都具有明显抑制病毒增殖复制的作用。研究表明BmATAD3A和BmHSPD1均能够和线粒体共定位，通过RNAi分析表明BmHSPD1基因对病毒复制的影响主要是受BmATAD3A调控。最后以ATAD3A为靶标基因构建了转基因品系，该品系能够高效抑制病毒复制。以上结果基本确定了LEF-11调控宿主细胞的网络模型，鉴定了LEF-11劫持宿主ATPase酶家族作用机制，创制了家蚕抗病毒素材创。该研究补充了BmNPV关键基因功能验证，完善了LEF-11劫持宿主细胞作用机制，为家蚕抗病育种提供了优秀的素材。