马奶酒中乳酸菌酒精胁迫响应机制的的研究

Koumiss is one of the fermented dairy products traditionally made by the minority in Xinjiang. During the fermentation, lactic acid bacteria (LAB) acidify the mare's milk, and yeasts yield alcohol which puts stress on LAB,and which will have effect on the normal physiological function of LAB. However, the alcohol stress responses of LAB have been rarely studied. Taking the LAB of Koumiss as the study object, the dominant LAB will be isolated and identified from Koumiss, and the alcohol -resistant strain will be scanned. The physiological responses of LAB during alcohol stress will be compared based on indexes of the cell ultrastructure, cell membrane components and function, key enzymes, and the inner micro-environment analysis. The comparative proteomic approach based on iTRAQ will be conducted to investigate the expression difference of proteins the LAB during alcohol stress.The chage of transcriptomics would be showed by RNA-seq. The Gene Ontology (GO) and pathway will be analysed that biased results on proteomics and transcriptomics data.And the metabolic network will be reconstructed . The key differences genes were verified by heterologous expression.So,the molecular mechanism of alcohol stress in LAB will be revealed.These results will provide theoretical basis for fermentation mechanism and metabolic regulation of the koumiss, and be helpful to the development and utilization of resources in the koumiss.

马奶酒是由乳酸菌和酵母菌共同发酵而成，酵母菌在发酵的过程中会对乳酸菌形成酒精胁迫，对乳酸菌正常的生理功能产生了影响。然而，目前，对酒精胁迫的条件下乳酸菌应激机制的研究较少。本项目在前期筛选出抗酒精胁迫菌株研究的基础上，通过比较分析乳酸菌酒精胁迫前后在生理功能方面的差异性，探讨乳酸菌的抗酒精胁迫生理应激机制。并引入蛋白质组学与转录组学关联分析的研究策略。通过i-TRAQ技术分析在酒精胁迫（不同强度如时间、浓度）前后蛋白表达的差异性。采用RNA-seq测序和深度的生物信息学分析乳酸菌的转录组变化。通过蛋白质组与转录组表达模式聚类分析，GO功能、Pathway的关联比较分析，构建相关调节通路，确定关键差异性基因并进行异源表达，验证其在乳酸菌酒精胁迫应激中的作用，从而揭示乳酸菌抗酒精胁迫的分子机理，为进一步研究马奶酒的发酵机制和代谢调控等提供理论依据，对马奶酒资源的开发和利用具有重要意义。

马奶酒为新疆少数民族的传统乳制品,是由乳酸菌与酵母菌共同发酵而成，其过程中不可避免地形成“酒精胁迫”环境，造成乳酸菌代谢紊乱，甚至死亡。提高乳酸菌乙醇胁迫后的活力，成为发酵工业亟待解决的首要问题。本研究以乳酸杆菌为研究对象，探究乳酸菌乙醇胁迫过程中的损伤机制。主要研究结果如下：采集于新疆不同地区的传统马奶酒中共分离得到乳酸菌271株，其中乳酸杆菌115株，乳酸球菌156株。经生理生化试验后进一步分为4属9种。对耐酒精胁迫菌株进行了筛选和适应性进化，筛选出面包乳杆菌D2-5， 植物乳杆菌D5-5，干酪乳杆菌D5-8和副干酪乳杆菌-LBK。以面包乳杆菌D2-5、植物乳杆菌D5-5 和干酪乳杆菌D5-8为研究对象，比较不同乙醇浓度胁迫后菌体存活率及活力，测定乙醇胁迫后菌体EMP途径中己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)、ATP酶及细胞膜特性的变化，分析乙醇胁迫造成菌体失活的主要因素。结果表明：8%(v/v)乙醇胁迫后的菌体存活率明显下降，面包乳杆菌D2-5、植物乳杆菌D5-5和干酪乳杆菌D5-8存活率仅为26.61%、23.50%和34.20%。酒精胁迫对菌体己糖激酶影响不大，对丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶和ATP酶效果显著，胞外β-半乳糖苷酶活升高。说明丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶和ATP酶失活是影响酒精胁迫损伤的关键因素，酒精胁迫致细胞膜通透性增加，细胞膜完整性破坏，细胞微观结构受损，从而抑制乳酸杆菌生长代谢，且酶活力变化与菌体活力相关。.以耐受性副干酪乳杆菌LBK为研究对象，基于RNA-Seq数据基础，发现了4个代谢相关基因与其酒精耐受性有关，并以PFK和GK为研究对象构建过表达载体，证明了甘油激酶GK基因、磷酸果糖激酶PFK基因是副干酪乳杆菌抵御酒精胁迫代谢调控机制的关键基因。利用TMT,技术研究了不同酒精浓度胁迫下副干酪乳杆菌LBK菌株的蛋白表达差异，共鉴定到蛋白1153种。通过GO功能显著性富集分析可知：随着酒精胁迫时间的延长，GO功能条目将增加，特别是更多的分子功能相关蛋白差异表达出现，细胞中会有更多的蛋白参与到更多的生理代谢中；整体而言，酒精胁迫将导致氧化还原反应稳态维持与应答、物质跨膜运输、遗传物质、碳水化合物的分解代谢过程的改变。通过 Pathway 显著性富集能确定差异蛋白参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。