马奶酒样乳杆菌基因编辑系统的构建及其糖基转移酶基因功能研究

Exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria can be used not only in the food industry as natural thickeners and texture improvers, but also in close relation to the beneficial functions of lactic acid bacteria in the human intestinal tract. The study of the function of EPS synthesis related genes of LAB not only helps to increase the production of exopolysaccharides, but also helps to analyze the relationship between molecular structure, metabolic regulation and biological functions. The amount of exopolysaccharides produced by Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 deposited in our laboratory reaches 2100 mg/L and can exert various beneficial functions in vivo. Based on the previous studies, this study will establish a highly efficient CRISPR/Cas9 gene editing system in Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 to study the function of the glycosyltransferase gene on the eps gene cluster and clarify its effects on exopolysaccharides production and structure. The results of this study not only help to improve the functional information of the glycosyltransferases involved in the extracellular polysaccharide synthesis of lactic acid bacteria, but also lay the foundation for the further metabolic engineering of Lactobacillus kefiranofaciens and the construction of high-yield strains that synthesize specific structural exopolysaccharides.

乳酸菌产生的胞外多糖不仅可用于食品工业作为天然的增稠剂和质地改良剂，而且和乳酸菌在人体肠道内发挥的益生功能密切相关。对乳酸菌胞外多糖合成相关基因的功能研究，不仅有助于提高胞外多糖的产量，还有助于解析胞外多糖的分子结构、代谢调控和生物学功能之间的关系。本实验室分离的马奶酒样乳杆菌ZW3胞外多糖产量达2100mg/L，并且可在体内发挥多种益生功能，具有很好的研究价值和应用前景。本研究拟在前期研究的基础上，通过在马奶酒样乳杆菌ZW3中建立高效的CRISPR/Cas9基因编辑系统，对该菌株胞外多糖合成基因簇上的糖基转移酶基因进行功能研究，以期阐明相关基因的在影响胞外多糖产量和结构方面的作用。本研究的结果不仅有助于完善乳酸菌胞外多糖合成相关的糖基转移酶的功能信息，并且为进一步对马奶酒样乳杆菌进行代谢工程改造，构建合成特定结构和功能的胞外多糖的高产菌株打下理论基础。

马乳酒样乳杆菌是开菲尔粒中的重要菌株，具有代谢合成胞外多糖的能力，是构成开菲尔结构、决定开菲尔发酵乳品质和发挥相关益生功能关键菌株之一。本研究前期分离得到了多株马乳酒样乳杆菌，并且发现了其在体内具有调节肠道菌群、抗过敏、改善抑郁样行为等益生功能。因而本研究希望通过构建马乳酒样乳杆菌中高效工作的基因编辑系统，对胞外多糖的合成机制进行研究。.本研究基于NCBI中已登记的7株马乳酒样乳杆菌，发现IIA类型的CRISPR-Cas9系统可能适合对马乳酒样乳杆菌进行基因编辑。但CRISPR-Cas9系统中Cas9的核酸酶功能较强，可能造成马乳酒样乳杆菌基因组DNA的双链断裂，易造成被编辑细胞的高死亡率。而CRISPR-Cas9D10A系统中的Cas9D10A核酸酶仅切割DNA中与sgRNA互补的单链，从而提高被编辑细胞的存活率。因此，我们选择Cas9D10A用于本研究中的CRISPR-Cas基因编辑系统的开发。.通过构建一个仅含有乳杆菌中复制原件和卡那霉素抗性基因的报告质粒，对本实验室保藏的7株马乳酒样乳杆菌进行了电转化实验，最终选择一株具有最高转化率的马乳酒样乳杆菌（Lactobacillus kefiranofaciens 1207）进行基因编辑系统的开发。获得的最适电转化条件为1800 V，电阻200 Ω，电脉冲25 μF。随后，我们根据1207的全基因组序列，在报告质粒的基础上设计了靶向删除一个糖基转移酶基因（gene1929）的基因编辑质粒，主要包括引导单链切割的sgRNA序列和用于同源重组的的两段同源臂序列的设计。随后，我们利用上述构建的CRISPR-Cas9D10A系统对1207中编码糖基转移酶的基因（gene1929）进行敲除，得到了单个糖基转移酶基因缺失的突变株，敲除效率为85.7%。.最后，通过分析野生型和糖基转移酶基因缺失型菌株的生长情况和胞外多糖产量，初步总结了糖基转移酶基因的功能。结果表明，与野生型菌株相比，糖基转移酶缺失型菌株的生长速率明显下降。胞外多糖的产量从野生型菌株的450 mg/L，下降为糖基转移酶基因缺失型菌株的298 mg/L。综上，本研究成功构建了可以在马乳酒样乳杆菌中高效工作的CRISPR-Cas9D10A基因编辑系统，并研究了糖基转移酶基因在细胞生长胞外多糖合成中的功能。