选择压力下H7N9禽流感病毒的准种演变规律及其意义研究

A severe disease in humans caused by a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus was identified in China in 2013, which has caused hundreds of infections and and dozens of deaths. The number of H7N9 cases is still increasing today. Our preliminary study showed that viral quasispecies were generated in the strain of H7N9 virus. It has been reported that the existence of quasispecies and its evolution can directly affect the biological properties of the virus, such as drug resistance, antigenicity, and pathogenicity, etc. Antiviral and immune selective pressures are the two main factors that can accelerate viral quasispecies evolution. Thus, investigation of the quasispecies evolution pattern of H7N9 virus will help us to dynamically understand the virus, and to find meaningful viral genome variation timely. Using high-throughput sequencing technology, this project will investigate the quasispecies evolution pattern of H7N9 virus under selective pressures, and pinpoint the effects of quasispecies evolution on the biological characteristics of H7N9 virus, such as drug resistance, antigenicity, and pathogenicity, etc. This study would probe into the variation trends of H7N9 virus at the molecular level, and provide guidance for the prevention and control of H7N9 avian influenza.

自2013年我国首次发现人感染H7N9禽流感病毒以来，全国共报告确诊病例数百人，致多人死亡，而且病例数仍在持续增加。在前期研究中，我们发现同一H7N9禽流感毒株中存在着大量的病毒准种。研究表明，准种的存在与进化直接影响到病毒的耐药性、抗原性和致病性等多种生物学特性，而抗病毒和免疫选择压力是加速准种演变的两个主要因素。因此，研究抗病毒和免疫选择压力下H7N9病毒的准种演变规律有助于我们从动态的角度去认识病毒，及时发现有意义的病毒基因组变异。本项目拟以高通量测序技术研究H7N9禽流感病毒在选择压力下的准种演变规律，并探讨H7N9病毒的准种演变对病毒的耐药性、抗原性和致病性等多种生物学特性的影响。本项目从分子水平上探究H7N9病毒的变异趋势及发生机制，为H7N9禽流感的防控和临床抗病毒治疗提供指导。

自2013年我国发现全球首例人感染H7N9禽流感以来，已发生五波疫情，感染造成多人死亡。研究表明，H7N9病毒已出现基因改变，不仅发生了适应性变化，而且已从低致病性向高致病性禽流感病毒进化。影响H7N9病毒准种形成与进化的因素主要有两个：一是病毒在复制过程中缺乏有纠错功能的酶，容易产生变异；二是选择压力的存在。NA抑制剂的药物压力是H7N9病毒所面临的主要选择压力之一，随着药物的使用，病毒的耐药变异已不可避免地发生。然而目前所报道的耐药变异多为从散发的病例中发现，尚未见系统性研究报道。本研究基于二代测序技术系统性研究了H7N9病毒在NA抑制剂选择压力下的准种演变，并分析这些演变特别是NA的变异对病毒生物学特性的影响。. 本项目的主要研究内容、重要结果及关键数据如下：1. 帕拉米韦选择压力的存在使得H7N9病毒在传代过程中基因组范围内更多位点的SNV增加至高频并趋于稳定，这些位点主要发生于HA和NA两个节段，提示产生了新的优势基因群。2. H7N9病毒的NA在帕拉米韦选择压力下发生了两个关键氨基酸位点变异：I222T和H274Y，两个位点的变异均始于第10代次，而后频率迅速增加。药物压力撤除对二者的变异频率无显著影响，说明它们在非药物压力环境下对病毒可能为中性突变。3. I222T变异降低了病毒对奥司他韦的敏感性，IC50值与对照组相比增加至8.63倍；而H274Y变异使得病毒对奥司他韦和帕拉米韦耐药，IC50值与对照组相比分别增加至130.15倍和10.18倍。与酶促反应结果一致，在细胞水平也获得了类似的结果。4. 通过观察病毒在MDCK细胞中的复制动力学发现，H274Y变异使得病毒在感染早期复制能力减弱，但并不影响病毒的峰值滴度；酶促反应动力学结果显示，NA-H274Y毒株的Vmax值下降了一半以上，Km值增加了2.53倍，表明其NA对底物的亲和力下降。5. 体内试验结果显示，NA-I222T变异使得H7N9病毒对小鼠的致病力增强。. 本项目研究结果对于预测病毒变异、指导临床用药以及进一步研究其致病机制均具有重要意义，为H7N9禽流感的持续监测评估、适时调整防控策略和治疗措施提供帮助。