金丹配伍通过Pink1/Parkin通路调节线粒体自噬对心肌缺血再灌注损伤模型影响的研究

Mitochondria are the main site of cell Redox reaction and play an important role in regulating homeostasis and maintaining normal physiological function. When the body is adversely affected by the environment, the Pink1/Parkin signaling pathway, which is characteristic of mammalian cells, activates the induction of mitochondrial autophagy. The signal transduction mechanism of apoptosis is very complex. The mitochondrial pathway is the most classical one, and apoptosis can be regulated by highly conserved endogenous anti- apoptosis factor family IAPs protein.. Based on the results of previous studies, we studied the relationship between autophagy and apoptosis of myocardium cells in combination with Jinsitao and Salvia miltiorrhiza. The mitochondrial autophagy of Pink1/Parkin pathway and the key target proteins of mitochondrial pathway were studied. Explaining the mechanism of Jindan compatibility to ischemic model and discussing the relationship between self-phage and self-phage.

线粒体是细胞进行氧化还原反应的主要场所，对调节细胞内环境稳态和维持细胞正常生理功能发挥着重要作用。当机体受不利刺激影响或病理性改变时，Pink1/Parkin信号通路激活诱导线粒体自噬，该通路是哺乳动物细胞的特有线粒体自噬通路；细胞凋亡是机体维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序死亡，细胞凋亡的信号转导机制十分复杂，其中以线粒体通路最为经典，凋亡可以被高度保守的内源性抗细胞凋亡因子家族IAPs蛋白调节。. 本研究拟在前期研究结果的基础上，以乌腺金丝桃与丹参配伍为受试药物，针对缺血再灌注损伤模型，研究心肌细胞自噬与细胞凋亡的相关性，进行哺乳动物细胞特有的线粒体自噬Pinkl/Parkin通路、以及细胞凋亡线粒体通路关键靶点蛋白质IAPs、BH3-only进行研究；阐释金丹配伍对心肌缺血模型的作用机制，探讨细胞自噬与细胞凋亡的相关性及关键靶点，同时为中药配伍理论提供科学实验数据佐证。

本研究以乌腺金丝桃与丹参配伍为受试药物，在研究确定受试药物质控条件的前提下，以心肌缺血再灌注损伤为模型，研究心肌细胞自噬与细胞凋亡的相关性，进行哺乳动物细胞特有的线粒体自噬Pinkl/Parkin通路、及细胞凋亡线粒体通路关键靶点蛋白质IAPs、BH3-only等进行研究；阐释金丹配伍对心肌缺血模型的作用机制，探讨细胞自噬与细胞凋亡的相关性及关键靶点。线粒体对细胞内环境稳态发挥重要作用，其中Pink1/Parkin信号通路是哺乳动物细胞的特有线粒体自噬通路，诱导激活线粒体自噬；再者细胞凋亡的信号转导机制，以线粒体通路最为经典，凋亡可以被高度保守的内源性抗细胞凋亡因子家族IAPs蛋白调节。.本实验研究采用超高效液相色谱-离子阱-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）联用技术，共鉴定22个成分，包括12个原型入血成分及10个代谢产物;经解析主要为丹参酚酸类、丹参酮类、黄酮类成分及其代谢产物，其代谢产物酚酸类成分小分子羟基化、甲基化、葡萄糖醛酸化物;丹参酮类成分羟基化、葡萄糖醛酸化；黄酮类成分甲基化、葡萄糖醛酸化及硫酸酯化物。药效学及机制研究,制备离体模心肌细胞H/R损伤模型；其CCK-8、LDH、ROS检测，心肌细胞H/R处理后细胞活性显著降低，JD、3-MA预处理组能显著提高H/R心肌细胞的活力，减少LDH漏出量，降低细胞内ROS的产生；Western blot及流式细胞术检测，细胞凋亡蛋白表达上调。而JD、3-MA预处理组能显著降低H/R心肌细胞凋亡蛋白Caspase 3的表达。电镜观察，H/R组细胞可见较多双层膜结构的髓样小体，自噬蛋白Beclin1、LC3II/I以及线粒体途径自噬相关蛋白PINK1、Parkin显著增加。在体模型研究，金丹可抑制心肌细胞过度凋亡。Western blot 法、免疫组化法检测，金丹组可明显提高大鼠心肌Beclin1、LC3BII/LC3BI、PINK1、Parkin蛋白表达，下调p62的蛋白表达；Realtime PCR法，金丹组可明显提高大鼠心肌PINK1、Parkin mRNA的表达。金丹能提高心肌细胞的抗氧化能力，抑制细胞过度凋亡，心肌病理组织损伤，抑制PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬过度激活，对MIRI大鼠心肌的保护作用。