下丘脑内视交叉上核投射区表达的PKR2受体分子在近日节律功能中的作用研究

Prokinecticn 2（PK2）是新近发现的神经性多肽,与其受体PKR2分别分布于视交叉上核和视交叉上核神经元的投射位点中，对介导中枢生物钟的近日节律功能可能十分重要。本项目将以SD大鼠为动物模型，对PK2/PKR2在中枢生物钟功能中的作用进行系统研究：我们将对大鼠PKR2的脑内解剖分布进行脑片的原位杂交分析及RT-PCR分析，阐明PKR2在下丘脑内视交叉上核投射部位的分布；通过在中枢神经内CTB神经元反向示踪剂的注射，阐明下丘脑PVH和DMH等区域PKR2神经元的投射。设计了针对PKR2的RNA干扰序列，制备表达相关shRNA的腺相关病毒载体；在动物脑内定点注射病毒载体，实现RNAi干扰从而降低PKR2的表达量；并通过ClockLab和VitalView系统分析PKR2基因对动物行为与生理功能的昼夜节律的影响；分析褪黑激素和糖皮质激素含量的变化，从而深入阐明昼夜节律现象产生的机制。

本项目在执行过程中遇到了多项困难，未能完成预定实验计划。主要原因如下：.由于使用同位素进行检测的诸多不便，我们目前采用DIG标记的方法对mRNA的表达进行原位杂交分析，并成功检测到Avp和Vip 的表达信号。但PKR2在下丘脑内表达较低，在多次尝试优化后，DIG标记的方法也始终无法检测到明显的表达信号。这样我们无法对PKR2的脑内表达进行有效定位，也无法对shRNA的干扰效果进行检测，使本项目的许多工作难以进行。其次我们的AAV2病毒滴度和效价始终难以达到脑内注射的需要。以上原因使本项目的实验计划无法顺利完成。.在本项目的资助下，我们还从事了与项目研究方向接近的研究工作，并取得了良好的研究成果。我们成功构建了Vip-Cre的转基因小鼠。我们采用同源重组技术，利用BAC载体，将Cre的编码区置于Vip基因的启动子之后。之后进行了小鼠受精卵的原核注射，得到Cre阳性小鼠，并对其进行了筛选鉴定，通过与ROSA26R小鼠交配和子代小鼠脑片的beta-Gal染色，间接分析Cre的脑内表达，成功筛选出在视交叉上核内表达Cre的阳性转基因小鼠。目前已经在C57BL6背景上回交了6代。同时我们也获取了Bmal-floxed的小鼠，可通过与Cre小鼠交配，对下丘脑视交叉上核内特定神经元进行Bmal1基因的敲除。以上的工作积累将有助于我们系统开展对下丘脑视交叉上核的神经元组织结构及其对昼夜节律的产生和传递的意义进行系统和深入的研究。.项目资助经费的使用与项目预算基本相符。在项目资助期间，项目组已发表了4篇论文（其中2篇为科研论文，1篇为综述，1篇为书籍的章节）。目前正在培养博士生4人，硕士生2人, 毕业硕士生两人。.