EB病毒通过gHgL二聚体与整合素α3β4亚基的相互作用感染鼻咽上皮细胞的研究

Nasopharyngeal carcinoma is a high incidence of malignant tumors in Southern China and Southeast Asia. Infection of EBV is closely associated with Nasopharyngeal carcinoma (NPC). Therefore, EBV was determined as the Ⅰ class of oncogenic virus by International Agency for Research on Cancer (IARC) of WHO. However, the receptor molecules and the mechanism of EBV infecting into nasopharyngeal epithelial cells have not been clearly elucidated. In this study, tandem affinity purification method with mass spectrometric analysis was used in this study and we found that integrin alpha 3 and beta 4 subunits directly interact with the surface glycoproteins of gHgL dimer encoded by EB virus. Then QRT-PCR and WB assay were applied to further prove that alpha 3 and beta 4 subunits get high expression in normal nasopharyngeal epithelial cells and nasopharyngeal carcinoma cells. In addition, the direct binding between alpha 3 and beta 4 subunits with gH were demonstrated using CO-immunoprecipitation assay. So in the following assays, the cellular co localization analysis, in vitro infection blocking experiments using a variety of factors, analysis of infection efficiency to the cell lines with alpha 3 and beta 4 subunit knockdown or overexpression and evaluation of EBV infection efficiency in transgenic mice will be exerted to comprehensive study alpha 3 and beta 4 subunits which play a key role of receptor molecule in the process of EB virus infecting nasopharyngeal epithelial cells. Identification of the cellular receptor molecule will shed a light for vaccine development against EBV. And it also can pave the way for design the small molecule inhibitor specifically target to the receptor molecule for blocking EBV infection. Therefore, finally all the findings will lay the theoretical foundation for the ultimate realization of preventing EBV infection.

鼻咽癌在我国华南和东南亚地区为高发恶性肿瘤，而鼻咽癌的发生与EBV的感染密切相关，因此EBV被世界卫生组织定为Ⅰ类致癌病毒。而EBV感染鼻咽上皮细胞的受体分子及感染机制尚未报道。在本项目前期工作中，我们利用串联亲和纯化-质谱分析的方法发现整合素α3和β4亚基可以与EB病毒表面糖蛋白二聚体gHgL发生直接的相互作用，同样荧光定量PCR和WB实验也证实在正常鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞中α3和β4亚基均有较高表达，进而通过免疫共沉淀实验验证了gH蛋白与α3和β4亚基都可以直接结合，后续将进一步通过细胞共定位分析、多因子的体外细胞感染阻断实验、α3和β4亚基敲低或过表达细胞株感染实验及转基因小鼠感染实验来综合研究α3和β4亚基作为EB病毒感染鼻咽上皮细胞关键受体分子的潜力。受体分子的鉴定可为EB病毒预防性疫苗研发和以受体为靶点的小分子抑制剂的研发提供理论基础。

鼻咽癌在我国华南和东南亚地区为高发恶性肿瘤，而鼻咽癌的发生与EBV的感染密切相关，因此EBV被世界卫生组织定为Ⅰ类致癌病毒。而EBV感染鼻咽上皮细胞的受体分子及感染机制尚未清晰报道。在前期研究中我们发现整合素α3和β4亚基可以与EB病毒表面糖蛋白二聚体gHgL发生直接的相互作用，所以我们开展了一系列的生化分子与细胞水平的实验来确证二者的相互作用，包括体外免疫共沉淀实验证实二者的直接相互作用；然后在细胞水平通过敲低或过表达整合素α3和β4亚基构建稳株，然后直接检测EB病毒的感染水平；希望在此基础上构建小鼠模型考察EB病毒感染能力的变化。.因此，围绕上述研究路线我们开展了EB病毒感染细胞模型的建立工作，并针对gLgH开展了特异性单克隆抗体库的筛选和建立工作，同时我们还成功建立了人源化小鼠淋巴瘤模型，这种模型为后续研究EB病毒感染、中和抗体及小分子药物的评价提供了工具。在上述工作中我们依次建立了基于EB病毒感染嗜性而产生的淋巴细胞感染模型和上皮细胞感染模型；同时我们借助小鼠杂交瘤技术和兔外周血B细胞分选技术成功筛选鉴定了多株针对gLgH的单克隆抗体，初步建立了相对丰富的抗体库，我们还对其中具有较强中和能力的单克隆抗体进行了详细的鉴定和中和机制的探究；此外，我们通过分选脐带血CD34+细胞回输到NSG背景小鼠体内成功构建了人源化小鼠，而且体内实验证实EB病毒可以成功感染这种人源化小鼠并且可以导致淋巴瘤的发生。.综上所述，在课题资助下，我们gLgH相关工作为基础开展了大量的基础和应用性研究，所建立的细胞模型和人源化小鼠动物模型为后续的EB病毒感染机制研究以及中和抗体和小分子药物的筛选工作奠定了坚实的基础。