TRAIL-CTP融合长效蛋白的表达筛选及生物活性分析

TRAIL could induce apoptosis in many kinds of cancer cells with preferable efficacy and safety which makes it an ideal target of cancer treatment. However, TRAIL is prone to be eradicated by glomerulus and the half-life period is short. So the elongation of its biological half-life could increase the treatment efficacy. CTP fusion protein is an emerging technology that prolongs the existence of proteins. CTP is an endogenous rich in glycosylation sequence. It didn't increase antigenicity or influence the receptor affinity and protein bioactivity. It has been successfully used in the development of long-term protein. This study tries to construct fusion protein eukaryotic expression vector of TRAIL and CTP in order to improve the pharmacokinetic characteristics and antitumor effects of TRAIL. First, we screen for high expression cell lines in eukaryotic expression vectors, then the purification of protein, and last, to observe the antitumor efficacy of TRAIL-CTP fusion protein. We intend to find a reliable method to make TRAIL long acting.

TRAIL能诱导多种肿瘤细胞凋亡，具有较好的有效性和安全性，是理想的抗肿瘤分子靶向生物靶点。但TRAIL易被肾小球清除，体内半衰期短，延长TRAIL生物半衰期能增强其治疗效能。CTP融合蛋白是近年兴起的一种新型蛋白长效化技术，CTP为内源性富含糖基化序列，该片段不增加蛋白质抗原性、不影响受体亲和力及蛋白生物活性，已成功用于长效蛋白开发。本项目拟构建TRAIL与CTP不同拷贝基因连接的融合蛋白真核表达载体，以期改善TRAIL药代动力学特性，实现TRAIL蛋白的长效表达，延长TRAIL在体内的半衰期，增强TRAIL的抗肿瘤疗效。本项目通过对真核表达载体加压筛选得到高表达细胞株，蛋白质纯化得到高纯度蛋白，在荷瘤小鼠模型和体外肿瘤细胞株中观察TRAIL-CTP融合蛋白抗肿瘤生物活性，通过药代动力学实验检测该融合蛋白半衰期，探索一种实现TRAIL蛋白长效化的可靠手段。

TRAIL 诱导肿瘤细胞凋亡，是理想的抗肿瘤靶点。TRAIL 单用疗效不佳，肿瘤广泛耐药，半衰期短，作用不持续。本研究对（1）TRAIL＋CTP融合蛋白表达载体的构建、表达和筛选；（2）TRAIL＋CPP融合蛋白的设计与构建表达；（3）TRAIL穿膜肽样突变体的设计与构建表达；（4）TRAIL穿膜肽样突变体的规模化制备；（5）TRAIL穿膜肽样突变体体内外生物活性筛选和研究，获得了数种TRAIL-CPP融合蛋白和TRAIL穿膜肽样突变体。经活性筛选，证明了（1）TRAIL-CPP融合蛋白、TRAIL穿膜肽样突变体与野生型TRAIL蛋白相比，具有更强的抗肿瘤作用，对于野生型TRAIL耐药的肿瘤细胞能够逆转药物耐受，药物敏感率接近80%，高于野生型TRAIL蛋白（50%）。（2）采用人肺癌NCI-H460细胞裸鼠皮下移植瘤模型，研究TRAIL-Mu3的抗肿瘤作用。结果显示，所有不同给药方案TRAIL-Mu3治疗组抗肿瘤作用大大优越于阳性药。TRAIL-Mu3每日给药方案T/C值为33.50%（P＜0.01）；TRAIL-Mu3隔日一次方案T/C值为17.63%（P＜0.001）；TRAIL-Mu3每周给药三次方案T/C值为16.75%（P<0.001）。TRAIL-Mu3隔日给药与每周给药三次给药方案疗效相当，优越于每日给药方案。TRAIL-Mu3持续抑制肿瘤的生长，疗效大幅度提升的同时实现了药物的长效化。项目首创了TRAIL穿膜肽样突变体全新蛋白突变形式，获得了数种优越的新型穿膜肽样突变体。与野生型相比，体外生物活性更强，敏感率更高。TRAIL-Mu3的单次给药剂量＞1500mg/kg动物安全。药物稳定，成药性好，应用前景广阔。项目解决了国际上TRAIL类蛋白二十年研究中的重大缺陷，通过改进的给药方案，TRAIL-Mu3在体内抗肿瘤作用上实现了长效化。项目首创了根据药物作用衰减的半衰期（而不是药物代谢半衰期）设定用药间隔，并取得初步成功，进一步完善、补充和丰富目前有关药物代谢与给药间隔的理论，具有极大的理论和应用价值。