TGF-β1修饰MSC调节移植胰、肾免疫耐受的分子机制研究

TGF - beta 1 and MSC can have the effect of transplantation immune response, TGF - beta 1 immune inhibition, immune regulation of mesenchymal stem cells (MSC) between activity and low immunogenicity, immunosuppression and immune regulating activity and transfection into MSC TGF - beta 1 can use MSC lymphocytes homing function, improve the TGF - beta 1 effect of targeting. Taking TGF - beta 1 gene, extraction, training, identification of receptor, MSC, MSC for exogenous gene transfection rate is high, the TGF - beta 1 gene transfer to the adeno-associated virus, by adeno-associated virus vector transfection to MSC to the decoration, at the same time play 1 immune regulation of MSC and TGF - beta, adjust inhibition function. Receptor 5 days before the pancreas and kidney transplantation, through peripheral vein infusion of TGF - beta 1 modified MSC, cut take donor pancreas and kidney transplantation in the receptors, dogs pancreas and kidney transplantation model is set up, postoperative receptors detect CD4 + CD25 + Treg cells, T lymphocytes in the spleen and the proportion of peripheral blood and Th1 / Th2, explore the TGF - beta 1 modified MSC inducing transplantation of pancreas and kidney function and molecular mechanism of immune tolerance and provide experimental basis for clinical application.

TGF-β1和MSC都能起到移植免疫反应的作用，TGF-β1的免疫抑制、免疫调节活性及间充质干细胞（MSC）的低免疫原性、免疫抑制、免疫调节活性且转染入MSC的TGF-β1能利用MSC的淋巴细胞归巢作用，提高TGF-β1作用的靶向性。切取TGF-β1基因，提取、培养、鉴定受体MSC，MSC对外源性基因转染率高，将TGF-β1基因转载到腺相关病毒中，通过腺相关病毒载体转染至MSC进行修饰，同时发挥MSC和TGF-β1的免疫调节、调节抑制功能。受体胰、肾移植前5天,通过外周静脉输注经TGF-β1修饰的MSC,切取供体胰、肾移植于受体,建立犬胰、肾移植模型,术后检测受体CD4+CD25+Treg细胞、T淋巴细胞在脾内和外周血比例及Th1/Th2变化规律,探索TGF-β1修饰MSC诱导移植胰、肾免疫耐受的作用及分子机制，为临床应用提供实验依据。

TGF-β1和MSC都具有免疫调节作用。切取TGF-β1基因转载到慢病毒中，通过慢病毒转染修饰MSC(MSC-TGFβ1)，同时发挥MSC和TGF-β1的免疫调节、免疫抑制功能。体外实验，通过混合淋巴细胞实验探索了MSC-TGFβ1对T细胞增殖的抑制作用。体内实验，按实验分组经外周静脉于术前5天给受体输注细胞,建立犬胰、肾联合移植模型,监测移植术后静脉血IL-2、IL-4、IL-10水平变化、胰腺功能及不同组移植物急性排斥反应程度,探索MSC-TGFβ1对胰肾联合移植急性排斥反应的影响及其分子机制。.本课题主要取得以下成果：（1）鉴定培养犬MSC，构建TGF-β1慢病毒载体、T细胞的分离纯化、慢病毒载体转染犬MSC及检测目的基因的表达、MSC混合淋巴细胞实验。结果证明目的基因成功表达，混合淋巴细胞实验发现MSC及MSC-TGFβ1对T细胞的增殖均有抑制作用，其中以MSC-TGFβ1与T细胞的比值1:10最为显著。CD4+T细胞和CD8+T细胞在MSC和MSC-TGFβ1刺激下都减少，且MSC-TGFβ1组比MSC组减少更明显。CD4+CD25+T细胞在MSC和MSC-TGFβ1刺激下会增加，在MSC-TGFβ1与T细胞的比值1：10的时候最高，显示其可上调CD4+CD25+T细胞比例。（2）体内实验研究MSC-TGFβ1对移植胰肾急性排斥反应的影响。在建立犬胰肾联合移植模型的基础上，观察TGF-β1、MSC和环孢素对移植胰腺功能的影响、外周血IL-2,IL-4,IL-10的变化及移植胰、肾病理学改变，探索MSC-TGFβ1对犬胰肾联合移植的免疫调节机制，综合分析移植前后静脉血血糖、C肽及尿淀粉酶发现输注MSC-TGFβ1并联合使用环孢素组移植胰腺功能最佳。分析移植前后外周血IL-2、IL-4、IL-10水平变化发现MSC-TGFβ1联合环孢素可通过促进IL-4表达，抑制IL-2表达。移植胰、肾病理学急性排斥反应分级及评分显示对照组排斥反应比实验组重，MSC-TGFβ1联合环孢素组急性排斥反应程度最轻。结合体内和体外实验，提示MSC-TGFβ1可减轻移植胰、肾排斥反应，且和MSC-TGFβ1浓度相关。其分子机制可能是诱导T细胞表达FOXP3，使非调节性CD4+CD25-T细胞分化成调节性TCD4+CD25+T细胞,发挥免疫调节活性，抑制效应T细胞的反应。