原始脊索动物Pax基因功能及文昌鱼实验室模式系统建立

由于进化地位的重要性和躯体结构的优势，文昌鱼被公认是下一个优秀的实验室模式动物，多年来人们希望将其模式化，但实验室条件下繁殖难一直是模式化进程中的最大障碍，近年美、法、日等已加紧了这方面研究。经过多年努力，我们于20006年率先在文昌鱼人工繁殖上取得重要突破，得到实验室F2代，现已成功建立了实验室繁殖群，同时在文昌鱼Pax基因结构和表达谱研究方面也取得重要进展。本项目将在此基础上，通过转基因和RNAi等基因功能抑制手段，研究文昌鱼胚胎发育和幼体长过程中Pax基因在器官发生和重建中的作用，探讨从原始脊索动物到复杂的脊椎动物进化历程中Pax基因功能演化及生物学意义，完善目前的文昌鱼转基因技术，并通过研制适合文昌鱼实验室养殖的设备、用人工海水驯化、研究加快生长发育和人工诱导定时产卵方法、培育近交系等，建立文昌鱼实验室模式系统，推动文昌鱼的模式化，使这一新型实验室模式系统在更广泛的范围内得到应用。

文昌鱼以其重要的进化地位、典型的脊索动物躯体结构和简单的基因组成等特征，被科学家们公认为发育生物学研究最好的模式动物之一。但文昌鱼的实验室繁殖难题长期以来一直是其作为模式动物应用的最大障碍，直到2006年文昌鱼实验室繁殖获得成功，意味着培育文昌鱼模式动物的可行性。.本项目最终目标是把文昌鱼培育成符合现代生命科学研究需求的实验室模式动物。主要研究内容包括实验室驯化、培育文昌鱼，研发人工诱导产卵方法和实验室养殖设施；针对文昌鱼受精卵的特点，建立适合文昌鱼的转基因技术；用RNAi等技术研究文昌鱼Pax基因在胚胎发育过程中的作用。.经过4年的不懈努力，在以下几个方面取得了显著进展:.1、用温度控制和营养调节方法，使成体文昌鱼的性腺发育周期由原来的1年缩短到65-70天（最短记录12天）；从孵化到第一次产卵的生长发育周期由原来的1-2年缩短至45-60天（个体差异大）。.2、用光周期调控和热诱导技术，打破了文昌鱼自然群体产卵时间的严格同步性，使实验室繁殖群中全年保持有性腺成熟待产个体，并且把文昌鱼产卵时间调节至白天；可用人工控温的方法诱导性腺发育充分的个体产卵，能够使单一个体在独立的产卵杯中产卵（精），建立了全年文昌鱼成熟卵（精）获取技术。.3、建立了重复性好、效率高的文昌鱼卵显微注射技术，一个稍加练习的操作者，一次即可显微注射1000枚左右卵，其效率与斑马鱼中的显微注射相当。.4、用受精卵显微注射siRNA和Morpholino等方法，研究发现文昌鱼Pax1/9基因与咽鳃裂的发育相关，进一步实验证明Pax1/9通过调控Tbx1/10的表达量来控制着咽弓的发育，同时也通过调节Six1/2及Eya的表达来调控鳃裂的发育。.5、克隆了文昌鱼的热启动子、通用启动子和多种具有促进组织特异性表达的CNE等，为外源基因转入和表达研究构建了若干个更加适合在文昌鱼中应用的基因表达载体。.6、研制了文昌鱼实验室养殖专用设施，并申请专利。.以上成果是我们继2006年国内外第一个得到人工繁殖文昌鱼子二代后，再次第一个实现如此大幅缩短文昌鱼生长发育周期、使其可全年产卵（精），首次建立了较成熟的诱导单一个体产卵（精）和稳定的受精卵显微注射技术。这一系列技术突破，标志着我们已打开文昌鱼模式动物化之门，这些技术现已成为本实验室常规技术手段用于文昌鱼转基因和基因敲除等研究。