戊型肝炎规范化实验室诊断模式的建立

HEV infection has become one of the most important risk factors of acute viral hepatitis. However, the lack of standardization of laboratory diagnostic procedures and evaluation system impair the efficiency of HEV serology and RNA detection. Quantitative PCR has been widely used in clinical laboratories for HBV and HCV nucleic's detection, while, fluorescence quantitative PCR for HEV nucleic acid is still in its infancy, and the building of nucleic acid standards and quality control serum plate is the very constraints. In this study, HEV cultured cells system will be used to build serum plate through multiple proportions dilution methods with pathogen-free serum, HEV plasmid DNA reference standards will be created as quantitative PCR standards. HEV ELISA kit effectiveness (including specificity and sensitivity) will be fully evaluated on our automatic diagnostic platform. To ultimately establish a standardized diagnostic procedure and evaluation system from HEV RNA extraction to RT-PCR and one-step quantitative PCR.

HEV感染已成为我国急性病毒性肝炎最重要的致病因素之一，然而HEV血清学及核酸的实验室检测，不仅缺乏十分有效的手段及规范化的实验室诊断流程和评价体系，更无统一的指导性原则。本人研究生阶段所在实验室设计开发了我国第一代戊型肝炎抗体和抗原ELISA检测试剂盒，对ELISA试剂盒开发和评估具有丰富经验。荧光定量PCR技术已广泛应用于临床实验室HBV和HCV的核酸定量检测，HEV 核酸的荧光定量PCR检测尚处于起步阶段，而构建标准品和考评血清盘是其关键制约点。本研究拟利用已构建的HEV细胞培养体系，通过阴性血清倍比稀释的办法来建立HEV质粒DNA标准品及考评血清盘，并利用我院检验科自动化检测平台，来全面评估目前主流戊型肝炎病毒ELISA检测试剂盒的检测效能，最终建立起标准化的从HEV 核酸提取到逆转录及PCR扩增的一步法荧光定量PCR检测平台及评价体系，并将其专利化商品化以应用于临床检测。

背景及目的：1.系统评估我国主流HEV抗原/抗体ELISA检测试剂盒的诊断灵敏度、特异度及相互间结果符合度，形成可指导临床实验室应用的HEV血清学检测试剂盒的质量报告，以规范戊型肝炎的实验室诊断流程。2. 设计出充分满足临床诊断灵敏度和特异度要求的能够检测HEV不同基因型病毒株的一步法荧光定量逆转录PCR（Real-time RT-PCR）检测体系，并初步建立起HEV RNA考评血清盘和质粒标准品，用于评价HEV核酸检测的质量评估。3.建立起不依赖特殊设备和专业人员操作的快捷高效检测HEV RNA 的逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)平台。重要结果：1. 不同厂家HEV IgM抗体检测试剂盒之间的检测结果差异较小，特异性较高；HEV IgG抗体检测试剂盒较IgM检测试剂盒更灵敏，但诊断特异度在不同厂家之间差异较大，科华IgG抗体检测试剂盒较适合于戊肝临床诊断检测，与IgM抗体检测试剂盒配伍使用，能很好地弥补其灵敏度不足，又能有效解决自身诊断特异度不足的问题。2. 万泰IgG抗体试剂盒较其它3种厂家灵敏度最高，更加适合于流行病学调查，科华试剂盒检测灵敏度较低不适合应用于流行病学调查。3. HEV抗原检测试剂盒与HEV RNA检测有很好的相关性，虽然其出现最早能有效缩短HEV感染的检测窗口期，但鉴于戊肝的发病特点，本研究未发现其能提高HEV感染诊断效率的证据。4. 本研究建立了能够高效扩增基因1-4型HEV RNA 一步法Real time RT-PCR检测体系，适用于血清和粪便等标本的检测，具有检测灵敏度、特异性高，重复性好等特点，值得进一步优化后进行商品化尝试。5. 本研究构建了Real time RT-PCR所需的质粒标准品，该标准品易制备、易精确定量，储存条件简单，稳定性好，解决了HEV RNA Real time RT-PCR检测临床实验室推广应用的瓶颈。 6. 本研究初步制备了HEV RNA检测考评血清盘，对Real-time RT-PCR检测HEV RNA的临床推广所面临的标准化和结果可控可比的问题进行了初步探索。7. 本研究初步建立了RT-LAMP技术检测HEV RNA的新方法，在特异度、灵敏度和临床标本检测验证中表现出了良好效果。