文昌鱼Pax基因簇中非编码保守序列的功能

我们最近在文昌鱼基因组Pax1/9位点发现一段与脊椎动物一致的同线性保守区，并在该区域内发现多个进化上高度保守的非编码序列(ncECR)，提示它们可能有重要生物学功能，同时还发现文昌鱼从胚胎发育到性成熟全过程中Pax基因在时空上呈现多峰交替表达,为探索这种表达变化与Pax基因簇非编码区的关系,本项目拟在已获得的Pax基因簇序列基础上，经序列比对找出在头索动物不同物种间以及头索动物与脊椎动物各代表类群之间Pax基因簇中的ncECRs，进而克隆这些非编码保守序列，构建红色荧光蛋白表达载体，用显微注射导入文昌鱼受精卵，观察胚胎发育过程中报告基因的表达，确定不同ncECR序列区段的功能以及它们在Pax基因时空表达变化中所扮演的角色。这一研究对揭示基因表达调控的分子机制和真核生物基因组中非编码序列的生物学功能有重要意义，同时在建立文昌鱼转基因技术、推进文昌鱼模式化应用方面也是有重要作用。

文昌鱼是现生生物中与脊椎动物最接近的非脊椎动物。我们前期研究发现，在文昌鱼基因组的Pax1/9 位点上有一段与脊椎动物一致的同线性保守区，并在该区域内发现了多个进化上高度保守的非编保守元件(CNEs)，提示它们可能有重要生物学功能。在本项目研究中，我们在此基础上对文昌鱼基因组中Pax基因家族非编码保守元件（CNEs）进行了系统地分析， 共鉴定出在全部后口动物中都保守的CNEs 30个；在脊椎动物亚门内保守的CNEs 101个；在脊索动物门内保守的CNEs 25个；在脊椎动物亚门和尾索动物亚门间保守的CNEs 10个；在头索动物亚门和脊椎动物亚门间保守的CNEs 94个。比较上游非编区域序列发现，Pax基因家族中Pax2/5/8基因上游保守的CNEs最多，我们将这些CNEs分别克隆并构建了LacZ重组质粒，用显微注射技术将重组质粒注入文昌鱼受精卵中，结果显示90%（9/10）的CNEs能够促使LacZ报告基因呈现一定程度的组织特异性表达，提示这些CNEs有着组织特异性增强子的功能；进而我们又对其中3个在后口动物中都保守的CNEs进行了进一步实验研究，证实高度保守的CNE无论其源自何种后动物类群，它们都具有相似的组织特异性增强子的功能。. 文昌鱼作为新型实验室模式动物，需要适合在文昌鱼中应用的高效启动子等分子生物学工具。我们发现文昌鱼Actin-6-2基因有2个转录本亚型，亚型II的启动子位于亚型I的第一内含子中，该启动子比亚型II的启动子的效率高，用本研究获得的高活性启动子构建LacZ重组质粒，在文昌鱼胚胎发育中可检测到91.5%的胚胎有LacZ信号，而同样条件下用商业化的高效启动子做的对照实验中，仅有38.2%的胚胎有LacZ信号。此外，我们还从文昌鱼热休克蛋白基因上游克隆获得具有热启动效应的启动子，其活性已在鱼的EPC细胞系和斑马鱼胚胎发育中得到验证，可以作为热诱导的分子开关，启动下游基因表达。