抗增殖蛋白在HCV感染肝细胞中的细胞生物学功能及其凋亡作用机制

HCV感染与肝细胞的相互作用是揭示HCV致病机制的重要内容，特异性敲除正常小鼠肝脏抗增殖蛋白（Prohibitin，PHB）后，肝脏则发生炎症、纤维化甚至肝细胞肿瘤。在前期对HCV全基因组转染细胞系统(Huh-7-HCV)比较细胞蛋白质组学的研究中发现：1）PHB表达上调；2）运用实时定量PCR和免疫印记技术证实PHB在该系统高表达。在此基础上提出PHB在HCV感染肝细胞中发挥重要作用（如促进凋亡等）的新见解。本课题拟进一步检测丙型肝炎患者血清和肝组织中PHB表达水平，分别构建PHB真核重组质粒和siRNA慢病毒质粒，转染体外细胞系观察PHB上调或下调表达对细胞生物学功能的影响，尤其是细胞凋亡作用并探讨PHB的作用机制。同时，观察在丙型肝炎患者干扰素治疗前后肝组织中PHB的表达情况，以期揭示PHB在HCV感染中的作用，为阐释HCV致病机制及探寻新的治疗药物或方法提供理论依据。

全世界大约有1.3~1.7亿人感染了丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV）,目前聚乙二醇干扰素和利巴韦林联合治疗丙型肝炎的应答率不超过55%。因此，对其致病机制的研究及探寻新的治疗药物或方法是目前亟待解决的问题。通过研究我们发现prohibitin（PHB）蛋白是最值得优先研究的目标蛋白之一。细胞凋亡在丙型肝炎患者肝组织广泛存在，HCV感染时，显微镜下常见到的肝脏组织中的嗜酸性小体其实质就是凋亡的肝细胞。阐释PHB在细胞凋亡中的作用将有助于揭示HCV感染肝细胞的分子病理机制，进而为探寻新的治疗药物和方法提供理论依据。.主要研究内容：.1. HCV体外细胞培养系统的构建及鉴定。.2. 以Huh7-HCV和Huh7.5-HCV细胞为研究对象，运用RT-PCR、Western blotting方法研究PHB的mRNA水平和蛋白水平。.3. 构建pEGFP-PHB真核表达重组质粒，转染人肝癌细胞HepG2和SMCC-7721。采用MTT法、流式细胞仪分别检测细胞增殖，细胞周期和细胞凋亡。.4. 将构建好的PHB siRNA慢病毒重组载体和pEGFP-PHB真核表达重组质粒分别感染和转染Huh7-HCV和 Huh7.5-HCV细胞，采用RT-PCR、Western blotting方法检测HCV RNA复制，核心core蛋白和NS3蛋白的表达。同时，PHB siRNA慢病毒重组载体感染Huh7和 Huh7.5细胞，检测IFN α、β的产生。.5. 通过应用双抗体夹心法ELISA定量检测63例慢性丙型肝炎患者及30例正常体检者血清PHB浓度，同时检测血清病毒滴度及肝功能指标。.获得的主要结论：.1. 成功构建了HCV体外细胞培养系统。.2. Huh7-HCV和Huh7.5-HCV细胞中PHB表达上调。.3. MTT和流式细胞仪检测表明PHB高表达可抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。这提示PHB蛋白可能通过促进细胞凋亡而在丙型肝炎的发病机制中发挥作用。.4. PHB低表达可抑制HCV RNA复制，core蛋白和NS3蛋白的表达。PHB siRNA慢病毒重组载体感染Huh7和 Huh7.5细胞可诱导IFN α、β的产生，PHB可能通过诱导干扰素的产生抑制HCV RNA复制。.5. 慢性丙型肝炎患者血清PHB含量低于正常人，与肝损伤的严重程度呈负相关。