HPLC-ICP-MS和砷荧光探针研究细胞内无机砷代谢及其影响因素

Our research will focus on the metabolism of inorganic arsenic in cells and its influence factors: (1) A series of novel fluorescent probes of arsenite、arsenate、MMA and DMA will be designed、synthesized and characterized by 1HNMR、ESI-MS and IR. High selectivity and sensitivity, long-wavelength excitation, excellent biocompatibility fluorescent probes which can be applied to detect arsenite、arsenate、MMA and DMA in cells, respectively will be screened using fluorescent spectrometry and fluorescence imaging techniques. (2) The possible intermediates (such as sulfur compounds of arsenic methylation、DMA、MMA, etc.) and end products will be studied by HPLC-ICP-MS to draw a typical pathway of arsenic metabolism in human liver cells (Primary human Hepatocytes or LO2 or chang liver cell) and HepG2. (3) The eukaryotic expression vector of human arsenic methyltransferas, pEGFP-N1-AS3MT, will be constructed and transfected into human urothelial cells (UROtsa cells) and leukemia cells (NB4 cells) and the stable expression cell lines will be established. The process of arsenic metabolism and the effects of different reductants、selenium and transition metals on arsenic metabolism in the level of transfected cells will be extensively performed to illustrate the process of arsenic methylation in detail. (4) The uptake and metabolism of inorganic arsenic will be tracked to give a scientific explanation of the distribution, migration and metabolism of arsenic in cells by the fluorescent probes real-timely and visually.

本研究课题将着重围绕"HPLC-ICP-MS和砷荧光探针研究细胞内无机砷代谢及其影响因素"开展如下几点工作：（a）设计和合成一系列亚砷酸、砷酸、MMA和DMA的荧光探针，结合荧光光谱和荧光成像技术筛选出选择性好、灵敏度高、激发波长长、生物相容性优良且能应用于活体细胞检测的新型砷荧光探针。（b）以人正常或原代肝细胞和HepG2细胞为模型，运用HPLC-ICP-MS研究砷代谢过程中的中间产物和终产物，从而绘制砷代谢的典型路线图。（c）构建人砷甲基化酶的真核表达载体pEGFP-N1-AS3MT，转染人泌尿道上皮细胞和人白血病细胞，建立稳定表达的细胞系，运用HPLC-ICP-MS研究无机砷在稳定表达细胞系中的代谢，并探讨不同还原剂、过渡金属元素及硒对细胞内砷代谢的影响。（d）运用荧光探针的实时可视化功能对无机砷的摄取和代谢进行跟踪，从而对砷在细胞内的分布、迁移和代谢给出科学的阐述。

本研究课题将着重围绕"HPLC-ICP-MS和砷荧光探针研究细胞内无机砷代谢及其影响因素"开展如下几点工作：（1）运用HPLC-ICP-MS研究了无机砷在HepG2细胞和白血病细胞NB4中代谢的中间产物和终产物，推测了砷在细胞中代谢路线图。（2）运用HPLC-ICP-MS研究了硒对无机砷在NB4细胞内代谢的影响，在细胞水平上进一步验证了砷硒拮抗的现象并初步提出了砷硒拮抗的机制。（3）运用HPLC-ICP-MS研究了DMSA对NB4细胞中砷甲基化的影响，初步探讨了DMSA的解毒机制。（4）应用RT-PCR以及western-blot等多种分子生物学方法探究了As3+，As4S4以及亚硒酸（Se4+）对APL细胞凋亡和分化的影响及相应的分子机制。实验结果表明，当As4S4在低浓度范围（0.1-0.4 μM）时，通过降解白血病蛋白-维甲酸受体α（PML-RARα）融合蛋白来诱导APL细胞分化；当As4S4在高浓度范围（0.5-2.0 μM）时，诱导相应的细胞通过与ROS相关的多种通路凋亡。2.0-4.0 μM的Se4+同时诱导APL细胞的凋亡和分化；Se4+（2.0-4.0 μM）主要通过抑制核因子-кB（NFкB）信号通路来诱导APL细胞凋亡，并通过降解PML-RARα融合蛋白来诱导细胞分化。As3+和Se4+（2.0-4.0 μM）联用不但可以促进APL细胞的凋亡和分化，还能降低细胞内由As3+引起的ROS累积。这说明，二者协同可以更好地治疗APL。（5）设计合成了PPi的荧光探针并将其应用在酶催化活性分析中。（6）设计合成了分别具有溶酶体和细胞膜靶向的阳离子型水溶性聚噻吩衍生物PEMTEI和PMTPP， 它们对ATP具有高选择性和灵敏度，且毒性低、生物相容性好、在细胞中光学稳定性高，可作为荧光探针分别应用于溶酶体和细胞膜ATP浓度变化的实时监测。运用PEMTEI和荧光成像技术，本论文首次发现，在药物刺激下，HeLa细胞中的溶酶体能够通过钙离子调节的胞吐作用释放ATP；进一步研究表明，在细胞凋亡过程中，细胞膜中的ATP水平上升。此外，PMTPP也可成功应用于小鼠肿瘤组织中ATP浓度变化的实时监测。