2-DE和MALDI 成像技术研究多氮化合物对HIF特定信号通路的调控

Our research will focus on the the effect of polynitrogen compounds on the HIF-special signal transduction pathway by 2-DE and MALDI-IMS. A series of novel polynitrogen compounds will be designed、synthesized and characterized by 1H NMR、ESI-MS、FTIR，and so on. The activity inhibition of proline hydroxylase by polynitrogen compounds will be studied by ITC LC-MS/MS and fluorescence spectrometry. Those polynitrogen compounds, screened as the inhibitors of proline ydroxylase, will be investigated their effects on the special signal transduction pathway (HIF-VEGF). Finally, the pathological changes and direct profiling of proteins from tissue using matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry will be evaluated the application of small molecular inhibitors in animal models.In-depth studies of the interaction between polynitrogen compounds and proline hydroxylase and its regulation of HIF-specific signal transduction pathway open up new areas for the treatment of hypoxic diseases.

本项目围绕"2-DE和MALDI 成像技术研究多氮化合物对HIF特定信号通路的调控"进行如下研究：（1）设计和合成一系列新型多氮类化合物，运用1H NMR、ESI-MS、FTIR等方法对化合物进行表征。（2） 结合ITC、LC-MS/MS和荧光等技术研究多氮化合物对脯氨酸羟化酶的抑制作用，筛选出具有抑制脯氨酸羟化酶活性和可调控HIF功能的小分子。（3）研究先导分子在肿瘤细胞中对HIF调控的特定信号转导通路（HIF-VEGF）的影响，获得对HIF有特异性调控作用的化学小分子探针，作为治疗心血管疾病的潜小分子药物。（4）建立实验动物模型，结合病理切片和MALDI成像技术进行小分子抑制剂处理前、后组织切片的病理变化和成像分析，从而评价小分子抑制剂在动物模型上的应用。通过深入研究多氮化合物与脯氨酸羟化酶的相互作用及其对HIF特定信号转导通路的调控为治疗缺氧性疾病提供有益信息。

本项目围绕"2-DE和MALDI 成像技术研究多氮化合物对HIF特定信号通路的调控"进行了系统研究，取得了以下有新意的研究成果：(1) 设计合成了8个唑类小分子，利用光谱（荧光光谱和圆二色光谱）和MALDI质谱探讨了唑类小分子与PHD3蛋白的相互作用，并通过计算模拟的方法得到小分子与蛋白的结合模式、推测了它们抑制酶活性的机理；进一步运用RT-PCR和Western-Blot研究了唑类小分子对特定信号转导通路HIF-GLUT/VEGF的调控。（2）设计合成了两个多氮锰配合物（13和14），研究了分子13和14对细胞内ROS水平进行调控，并运用RT-PCR、WB和SiRNA等方法探究了分子13和14对HIF相关信号通路（HIF-VEGF/EPO/HO-1）的调节作用以及对分化的大鼠嗜铬细胞瘤细胞（PC12）和原代神经元细胞应对氧化损伤的保护作用。（3）设计合成了两个脯氨酸底物类似物PA1和PA2，研究了PA1和PA2对脯氨酸羟化酶活性的影响；进一步运用RT-PCR和Western-blot等方法研究了化合物PA1对HIF-VEGF信号转导通路的调控，同时，运用2-DE和MALDI-TOF/TOF-MS鉴定得到了PA1引起的NCI-H446细胞内9个显著差异表达的蛋白，其中丙酮酸激酶M1/M2（PKM）和α烯醇酶（ENO1）是细胞糖酵解的关键调控因子，且活性直接受HIF-1α调控。 (4)运用MTT法研究了Zn2+-四氮环配合物（L-Zn）对癌细胞株，正常细胞株和顺铂耐药细胞株的细胞增殖影响，并运用RT-PCR和Western-blot研究了L-Zn对HIF-1α及其下游靶基因（GLUT1和VEGF）表达的影响，进一步利用皮下种植H22肝癌的ICR小鼠模型评估了L-Zn的体内抗肿瘤活性，L-Zn的抗肿瘤活性存在剂量依赖效应，表现出良好的抗肿瘤活性；进一步运用RT-PCR、WB及流式细胞技术等方法研究了L-Zn对HepG2细胞凋亡的影响作用及其机制，并通过2-DE结合质谱技术研究了L-Zn诱导HepG2细胞全蛋白的变化，发现了18个表达有差异的蛋白质点，主要是细胞新陈代谢，调节基因表达和细胞凋亡相关的蛋白。