CRISPR/Cas9介导的染色体转位与剂量补偿效应研究

In many organisms sexual fate is determined by a chromosome-based method which entails a difference in sex chromosome-linked gene dosage. Consequently, a gene regulatory mechanism called dosage compensation equalizes X-linked gene expression between the sexes. There are many sequence elements localized on X-chromosome that recruit proteins factors and noncoding RNAs to direct heterochromatin formation and transcription regulation. Deregulation of dosage compensation results in developmental defects and human diseases. In this study, we propose to generate chromosome translocations by using dual sgRNA-directed CRISPR/Cas9 technology in C. elegans. We will use quantitative real time PCR to examine gene expression levels under different chromosome microenvironments, use chromatin immunoprecipitation assay to detect the association of Dosage Compensation Complex to X-chromosome. This study will help us to understand the mechanism of gene regulation by chromosomal microenvironments, and facilitate our study of human diseases.

剂量补偿效应指的是在XY性别决定机制的生物中，使性连锁基因在两种性别中有相等或近乎相等的有效剂量的遗传效应，从而在雌性和雄性细胞里，由X染色体基因编码产生的蛋白质产物在数量上相等或近乎相等。X染色体上存在一些性别决定的序列元件，招募蛋白质因子和非编码RNA，来诱导异染色质形成和调节转录活性。剂量补偿效应的去调节往往会造成发育缺陷与疾病。我们希望在模式生物秀丽线虫里运用双sgRNA介导的CRISPR/Cas9技术诱导染色体易位，来研究染色体稳定性维持的机制以及性别代偿效应的机制。通过系统性地交换常染色体与性染色体片断，同时使用实时定量PCR检测常染色体与性染色体的基因表达水平，使用染色质免疫沉淀技术检测剂量补偿复合物在X染色体上的结合水平，来研究染色体微环境的改变对X染色体上基因表达的调控。这一研究有助于我们深入了解染色体微环境对基因表达的调控机制，也为人类染色体疾病研究带来新思路。

剂量补偿效应指的是在XY性别决定机制的生物中，使性连锁基因在两种性别中有相等或近乎相等的有效剂量的遗传效应，从而在雌性和雄性细胞里，由X染色体基因编码产生的蛋白质产物在数量上相等或近乎相等。剂量补偿效应的去调节往往会造成发育缺陷与疾病。在项目和其他项目的共同支持下，我们发现了调控piRNA转录的上游序列转录复合物; 发现了反义核糖体小干扰RNA及其产生通路; 发现了细胞质RNA干扰通路与获得性遗传的关系，并发展了线虫中的基因编辑技术。在G&D, PNAS, NSMB, Cell Reports等杂志上发表研究论文5篇，撰写综述4篇。..（1）我们通过功能基因组学的方法，结合免疫共沉淀加上质谱学的方法寻找piRNA产生相关因子；然后在秀丽线虫中进行功能验证，发现了一个上游序列转录复合物(Upstream Sequence Transcription Complex (USTC))介导了piRNA转录单元的起始。 (Genes & Development, 2019).（2）发现了一类受环境刺激调控的针对rRNA的siRNA(risiRNA)； risiRNA可以通过细胞核RNA干扰通路调控rRNA表达。这类risiRNA在线虫正常生理生活状态下表达被抑制，当遇到环境刺激或者某些关键基因突变时，这类risiRNA会富集，反过来通过Nrde通路抑制pre-rRNA的表达。(PNAS，2018；Nature Structural & Molecular Biology，2017).（3）我们发现细胞质RNAi机器也参与RNA干扰的多代遗传，其中细胞质的Argonaute蛋白WAGO-4起了至关重要的作用。(Cell Reports, 2018).（4）运用双sgRNA介导的CRISPR/Cas9技术诱导不同染色体之间的易位以及同一染色体内部的倒置。这些易位或倒置后得到的染色体可以被第二轮CRISPR/Cas9技术介导基因编辑，产生平衡子，从而为编辑关键基因和保存致死突变体提供了新的手段。(G3,2018)..以上这些研究成果进一步阐明了染色体微环境对基因表达的调控机制，也为人类染色体疾病的研究带来新的思路。