CRISPR/Cas9介导靶向hROSA26位点插入嵌合免疫受体基因增强NK92细胞抗肿瘤作用及其机制研究

With the development of CAR (chimeric antigen receptor) technology, cellular adoptive immunotherapy is becoming more and more important in the comprehensive treatment of cancer. However, CAR is usually integrated into effector cells randomly, which may result in clonal expansion, Insertion mutation and transcriptional silencing. There are also some other problems such as durability, off-target effect and limited curative effect on solid tumors. The applicant explored the design of PD1-NKG2D-41BB chimeric receptor system to modify NK cells, compared with the targeting effect of CAR on a specific antigen, it recognizes cancer cells through PD1/PD-L1 pathway, and most of the cancer cells express PD-L1, which makes its targeting effect on cancer cells more broad-spectrum. In the previous work, the applicant transfected NK cells with lentivirus vectors, and the anti-tumor effect of the engineered NK cells was significantly enhanced but not sustained enough. Further experiments revealed that PD-1 could not express stably and persistently. Based on this, the project intends to establish a chimeric immune receptor gene expression system using CRISPR/Cas9 technology at the "safe harbor" locus of NK cell hROSA26 to make it safely and continuously expressed, so as to greatly enhance the anti-tumor effect of NK cells, and to explore the anti-solid tumor mechanism of reprogrammed NK cells at the cellular and animal levels.

随着CAR(嵌合抗原受体)技术的发展，细胞过继性免疫疗法在肿瘤综合治疗中越来越重要。然而CAR往往是随机整合至效应细胞中，这就可能导致克隆性扩增、插入突变或转录沉默等，也存在持久性、脱靶效应及对实体肿瘤疗效有限等问题。申请人探索设计PD1-NKG2D-41BB嵌合受体系统改造NK细胞，与CAR针对某一种抗原的靶向作用相比，其通过PD1/PD-L1通路识别肿瘤细胞，而多数肿瘤细胞均表达PD-L1，使得其对肿瘤细胞的靶向作用更具广谱性。申请人前期工作采用慢病毒载体转染NK细胞，改造后NK细胞的抗实体瘤效应显著增强却不够持久。进一步实验揭示，是PD-1不能稳定持久表达所致。本项目拟在此基础上，利用CRISPR/Cas9技术在NK细胞hROSA26“安全港”位点建立嵌合免疫受体基因表达系统，使其安全、持久表达，以大大增强NK细胞抗肿瘤作用，并在细胞和动物水平探讨改造后NK细胞抗实体瘤作用机制。

本项目针对当前临床抗肿瘤免疫细胞治疗对实体瘤难以奏效这一突出问题，基于合成生物学重设计理念，开展人工合成功能性免疫分子模块及其应用于肿瘤治疗研究，结合自主研发的人工分子模块三维结构建模设计方法，并利用CRISPR/Cas9技术在NK92细胞安全位点精确插入和稳定持久表达嵌合受体，解决了人工分子模块的理性设计、CAR-NK细胞制备中基因转导及表达效率等共性关键难题，成功制备了一系列具有精准识别和显著杀伤功能的CAR-NK细胞。主要包括：基于新设计的嵌合受体分子模块发挥信号转换“开关”作用，利用多数肿瘤细胞均表达PD-L1的特性通过PD1/PD-L1通路来识别肿瘤细胞，使得改造后NK92对肿瘤细胞的靶向作用更具广谱性，而不仅仅局限于一种或几种特异性抗原靶标。此外，我们设计并构建出一种双靶向嵌合受体，利用PD1与PD-L1以及NKG2D与MICA/MICB的识别作用通过DAP10信号触发NK92细胞的激活，以大大增强其抗肿瘤免疫效应。实验结果显示，本项目相关所设计构建的3个人工嵌合受体分子模块在修饰NK92细胞后，相较于亲本NK92细胞均表现出显著增强的抗肿瘤效应；同时，又进行了临床前动物模型实验初步评价所制备 CAR-NK细胞的临床抗肿瘤安全性和有效性。此外，所设计新型CARs通过改造临床应用安全且可体外扩增的NK92细胞有望突破自体CAR-T/NK细胞疗法的局限，实现同种异体过继治疗，成为通用型、现货式细胞免疫疗法，可大大缩短治疗周期、降低治疗成本，将进一步推动肿瘤免疫细胞疗法的临床应用普及和推广，在肿瘤精准免疫细胞治疗领域具有较好的应用前景。总之，该研发工作为抗肿瘤免疫治疗提供具有自主知识产权的新型细胞技术产品，有望成为治疗肿瘤患者新的有效手段，将会产生良好的经济效益和社会效益。